組合代謝調控提高大腸桿菌對氨基苯甲酸產量

徐毅誠，路福平，王欽宏

組合代謝調控提高大腸桿菌對氨基苯甲酸產量

徐毅誠1,2,3，路福平1,3，王欽宏2

1 天津科技大學 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457 2 中國科學院天津工業生物技術研究所 中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308 3 天津科技大學 生物工程學院，天津 300457

對氨基苯甲酸是一種重要的有機合成中間體，廣泛應用于醫藥、染料等行業。近年來對氨基苯甲酸作為一種潛在的高強度共聚物單體越來越受到重視。對氨基苯甲酸作為葉酸合成的前體之一，其合成在大腸桿菌體內由葉酸合成途徑的和三個基因負責，催化分支酸合成對氨基苯甲酸。本研究以實驗室構建的酪氨酸高產工程菌 TYR002作為出發菌株，首先弱化雙功能分支酸突變酶/預苯酸脫氫酶 TyrA的表達，以減少酪氨酸積累，然后利用3種不同強度的組成型啟動子分別調控和的表達。搖瓶發酵表明不同的組合調控模式下大腸桿菌發酵培養基中的對氨基苯甲酸積累量存在顯著差異，最高可獲得0.67 g/L的搖瓶發酵產量。進一步通過發酵條件優化和分批補料發酵，在5 L發酵罐中獲得了6.4 g/L的對氨基苯甲酸產量。本研究為改善對氨基苯甲酸生物合成效率提供了重要理論參考。

對氨基苯甲酸，大腸桿菌，組合調控，代謝工程，葉酸合成途徑

對氨基苯甲酸(4-aminobenzoic acid或者para-aminobenzoic acid，PAPA) 是一種應用廣泛的化工原料，可作為醫藥和染料的中間體，也是細胞生長和分裂所必需物質葉酸的合成前體[1]。目前對氨基苯甲酸主要由石油中提取的甲苯經過氧化、硝化、最后加氫還原制取。近幾年材料學方面的研究顯示，對氨基苯甲酸有潛力用于生產包括工程塑料在內的芳香族高分子聚合物以及抗菌材料，同時美國國防部的Living Foundries項目也將對氨基苯甲酸視作一種能夠合成高強度高聚物但合成困難的化合物[2]。因此，對氨基苯甲酸的合成受到越來越多的關注。

大多數微生物都具備通過莽草酸和葉酸途徑合成對氨基苯甲酸的能力(圖1)。莽草酸途徑從4-磷酸赤蘚糖(E4P) 和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP) 縮合形成3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖-7-磷酸(DAHP) 開始，逐步反應形成的分支酸是一種用于合成芳香族化合物的中間代謝產物[3-5]。葉酸合成途徑中的3個酶參與分支酸經4-氨基-4脫氧分支酸(4-ADC) 到對氨基苯甲酸的轉化過程[6-10]。首先，谷氨酰胺氨基轉移酶(編碼) 獲取谷氨酰胺的氨基，隨后，4-氨基-4脫氧分支酸合成酶(編碼) 催化谷氨酰胺提供的氨基與分支酸4位點上的羥基進行置換，使之轉化為4-氨基-4-脫氧分支酸。最后一步是由4-氨基-4-脫氧分支酸裂合酶(編碼) 催化脫去丙酮酸后環化形成對氨基苯甲酸。

正常生長情況，微生物幾乎不積累或少量積累對氨基苯甲酸。隨著合成生物學與代謝工程的快速發展，設計構建微生物工程菌來發酵生產對氨基苯甲酸逐漸受到重視[11-13]。在大腸桿菌中，編碼3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶反饋抑制解除突變基因aroF和分別在誘導型T7lac啟動子控制下被整合到基因組中，并且提高和基因拷貝數可以有效提升對氨基苯甲酸合成效率，最后構建的大腸桿菌工程菌在分批補料發酵條件下，最高獲得35 mmol/L (約4.8 g/L) 的對氨基苯甲酸(每摩爾葡萄糖產率為21%)[11]。通過代謝工程手段改造獲得的釀酒酵母和谷氨酸棒桿菌工程菌也實現了對氨基苯甲酸的生物發酵生產[12-13]。

本研究組前期通過代謝工程改造獲得了一株高產3-脫氫莽草酸的大腸桿菌工程菌WJ60，其5 L罐分批補料發酵的3-脫氫莽草酸產量達95 g/L[14-15]，該菌株有望提供足夠的莽草酸合成途徑相關代謝產物，以獲取更高產量的對氨基苯甲酸。本研究以WJ60中恢復基因弱化調控的產酪氨酸工程菌株TYR002[14]為出發菌株，在弱化雙功能分支酸突變酶/預苯酸脫氫酶TyrA減少酪氨酸積累的基礎上，通過對重組質粒攜帶的、和基因進行不同強度組成型啟動子控制的組合代謝調控，嘗試提高大腸桿菌在沒有誘導條件下發酵生產對氨基苯甲酸的能力，為對氨基苯甲酸高效生物合成奠定基礎。

圖1 大腸桿菌對氨基苯甲酸生物合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

本試驗所用菌株與質粒如表1和表2所示。

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素(工作濃度100 μg/mL)、氯霉素(工作濃度33 μg/mL)、奇霉素(工作濃度50 μg/mL)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TransStart Fast Pfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司，與參考文獻[17]同名試劑一致；質粒小量快速提取試劑盒、2×PCR MasterMix、DNA Marker購自康為世紀公司；對氨基苯甲酸標準品購自國藥集團；其他試劑均為分析純。HⅠ、Ⅰ、T4 DNA連接酶、T4 DNA磷酸化酶(T4 PNK) 均來自Thermo公司。Clone ExpressTMII一步克隆試劑盒來自諾唯贊公司。

1.1.3 培養基

LB 培養基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出物 5，氯化鈉10(固體培養基加入1.5%瓊脂粉)，與參考文獻[17]同名培養基一致。

搖瓶發酵NBS培養基(g/L)：K2HPO4·3H2O 6.5，KH2PO43.5，MgSO4·7H2O 0.25，(NH4)2HPO43.5，CaCl2·2H2O 0.015。微量元素(mg/L) 包括：FeCl3·6H2O 1.6，CoCl2·6H2O 0.2，ZnCl20.2，CuCl2·2H2O 0.1，Na2MoO4·2H2O 0.2，H3BO30.05，與參考文獻[17]同名培養基一致。

發酵罐發酵種子培養基為LB培養基。發酵罐發酵培養基(g/L)：MgSO4·7H2O 2，K2HPO4·3H2O 7.5，(NH4)2SO41.6，檸檬酸 2，FeSO4·7H2O 0.077 5。微量元素(g/L) 包括：Na2SO40.02，CuSO4·5H2O 0.000 6，ZnSO40.0064，CoCl2·6H2O 0.004，與參考文獻[17]同名培養基一致。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構建

整合到表達載體中的由低強度到高強度的組成型啟動子P、P、P[19](表3) 與大腸桿菌的、B、C以及T7終止子串聯表達載體構建如下。

1) pACYC184-P-T7 (=、或) 質粒的構建：以pACYC184質粒為模板，用引物(pACYC184-pabC-F和pACYC184-pabC-R) 進行擴增，獲得線性的載體片段。以TYR002菌株基因組為模板，用引物(P1/P2/P3--F和-T7-R) 進行擴增，獲得P1/2/3--T7片段。用Thermo T4 PNK磷酸化酶對P1/2/3-- T7片段進行磷酸化，然后將線性化的pACYC184載體與磷酸化的P1/2/3--T7進行連接。將連接產物轉化大腸桿菌DH5a后，挑取單菌落送樣測序驗證正確的載體進行下一步構建。

表1 本研究的菌株

* An asterisk indicates that the first base in the coding region is changed from A to T.

表2 本研究的質粒

2) pACYC184-P-T7-P-T7 (或=、或) 質粒的構建：用HⅠ和Ⅰ限制性內切酶雙切pACYC184-P-T7 (=、或) 質粒。以 TYR002菌株基因組為模板用引物(HⅠ-P1/P2/P3-F和-T7-Ⅰ R) 擴增，獲得帶有HⅠ和Ⅰ酶切位點的P1/2/3--T7片段。用HⅠ和Ⅰ內切酶雙酶切純化后的P1/2/3--T7片段。用T4 DNA連接酶連接酶切后的載體和片段。將連接產物轉化大腸桿菌DH5a后，挑取單菌落送樣測序驗證正確的載體進行下一步構建。

3) pACYC184-PABA-(=1，2，…，或27)質粒的構建：以pACYC184-P-T7-P- T7 (或=、或) 質粒為模板，用(pACYC184F/R) 引物進行擴增，獲得線性化的載體片段，以TYR002菌株基因組為模板，用引物(P1/P2/P3--F/R) 進行擴增，獲得P1/2/3--T7片段，用諾唯贊克隆重組試劑盒按照生產商建議流程及實驗標準進行操作，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a后，挑取單菌落送樣測序驗證獲得正確的表達載體。

具體構建片段與整合流程如圖2所示。本研究中所用引物見表3。

1.2.2基因弱化載體pTargetT-↓的構建

由華大基因北京合成部合成弱化用供體DNA片段(整合序列見網絡版附件，共計636 bp)亞克隆至pTargetF載體[18]上，根據切割位點序列結合NCBI blast功能設計弱化用crispr-cas9 N20序列(序列為5′-GACGGCTCGCGTGGCTTA AG-3′)，利用引物(Promoter sgRNA F/R) 反擴至pTargetF載體，以thermo T4 PNK磷酸化酶對反擴后片段進行磷酸化，以T4 DNA連接酶進行連接，將連接產物轉化DH5后，挑取單菌落溶于LB液體培養基，送樣測序驗證。

1.2.3基因弱化菌株構建

在TYR002菌株中，與基因為串聯在同一啟動子后的多順反子結構，通過CRISPR-Cas9系統在與基因間插入T7終止子與P1啟動子，同時將基因的ATG起始密碼子改為TTG，實現了基因的弱化表達。經由CRISPR-Cas9系統的弱化操作流程參照文獻[18]所述。

1.2.4 搖瓶發酵與發酵罐補料發酵

搖瓶發酵生產對氨基苯甲酸：挑取單菌落到含有2 mL LB的試管中，30 ℃、200 r/min培養12 h，200 μL接種到10 mL NBS培養基中17 μg/mL氯霉素，35 ℃、250 r/min 培養48 h，分別在 24 h和48 h取樣用于對氨基苯甲酸產量的測定。

圖2 重組表達質粒構建示意圖

表3 本研究所用的引物

The underlined is the sequence of synthetic promoter corresponding to the primer name.

發酵罐補料發酵生產對氨基苯甲酸：挑取單菌落到含有3 mL LB中，30 ℃、250 r/min培養12–18 h，再將1 mL培養液接種于200 mL種子培養基中，30 ℃、250 r/min培養12–16 h，然后將200 mL種子液接種到裝有1.8 L發酵培養基、氯霉素起始濃度為22.6 mg/L的5 L發酵罐中，在35 ℃、pH 7、溶氧30%的條件下發酵。嚴格控制培養基中殘糖含量低于5 g/L。以氨水調控pH。從16 h開始，每隔4 h取樣檢測發酵液中的葡萄糖、酪氨酸以及對氨基苯甲酸含量。

1.2.5 代謝產物和菌體量檢測

利用生物傳感檢測儀來確定發酵液中葡萄糖消耗量，以高效液相色譜儀檢測對氨基苯甲酸和酪氨酸的積累量。取發酵液用0.1 mol/L濃度的鹽酸稀釋適當倍數后取0.5 mL于12 000 r/min離心5 min，取上清液制樣，上液相。檢測條件：UVD檢測器，Innoval C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A為水︰磷酸=1 000︰1 (，占80%)，B為甲醇(占20%)，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長分別為266 nm、280 nm。每個待測樣品分別有3個平行樣，實驗結果取自3個平行的平均值。用對氨基苯甲酸以及酪氨酸標準品構建HPLC標準曲線。用分光光度計于600 nm處測定600值作為單位時間的菌體量。

2 結果與分析

2.1 tyrA弱化表達對對氨基苯甲酸生產的影響

前期構建的菌株TYR002可以在搖瓶發酵過程中積累酪氨酸[14]。根據圖1代謝途徑所示，分支酸既是合成對氨基苯甲酸的重要代謝中間產物，也是合成酪氨酸的重要代謝中間產物，對氨基苯甲酸和酪氨酸的合成存在碳流分配競爭的問題。因此，為了增強流向對氨基苯甲酸合成途徑的碳流提高其合成能力，需要阻斷或弱化酪氨酸的合成途徑。在出發菌株TYR002中，利用CRISPP/Cas9基因編輯的方法，通過在基因前插入T7終止子和弱啟動子P1構建了PABA0，降低了底盤細胞在發酵過程中的酪氨酸積累量。在TYR002和PABA0轉入表達對氨基苯甲酸合成基因、和的重組質粒pACYC184- PABA-4 (表2) 進行了搖瓶發酵分析。48 h搖瓶發酵結果表明(圖3)，基因弱化后對氨基苯甲酸產量明顯增加，從弱化前的109 mg/L 上升到362 mg/L，產量增加超過3倍。同時酪氨酸的積累也明顯下降，從弱化前的2.64 g/L下降到2.19 g/L，下降了17%。由于還 是有大量的酪氨酸積累，所以進一步弱化調 控應該可以繼續提高對氨基苯甲酸的合成能力。

圖3 攜帶重組質粒pACYC184-PABA-4的E. coli TYR002(tyrA未弱化菌株) 與E. coli PABA0 (tyrA弱化菌株)搖瓶發酵生產結果

2.2 不同強度啟動子組合調控pabA、pabB和pabC表達對對氨基苯甲酸合成的影響

由圖1對氨基苯甲酸合成途徑可知，從分支酸到對氨基苯甲酸涉及、和三個基因。在正常條件下，大腸桿菌只能少量積累對氨基苯甲酸(圖4，對照菌株Control)。因此，為了提高對氨基苯甲酸的合成能力，需要對、和三個基因進行表達調控。本研究選取了3種表達強度由低到高大致為1︰10︰50的P1、P2和P3 (啟動子序列見表3)[19]，分別與、和三個基因進行組合，構建了27種不同組合的重組表達質粒(表2)。把這 27種不同組合的重組表達質粒分別導入弱化的大腸桿菌PABA0獲得27個工程菌株。然后通過搖瓶發酵分析不同組合表達調控對對氨基苯甲酸生產的影響。由圖4A和B可知，無論在24 h還是48 h發酵條件下，、和三個基因的不同組合表達調控顯著影響對氨基苯甲酸的生產，最高產量是最低產量70倍，而且發酵時間的變化對產量沒有產生大的影響。在27種不同組合表達中，由P1控制、P1控制和P2控制的組合獲得了最高的對氨基苯甲酸產量，達到420 mg/L，表明合適強度組合是保持代謝途徑暢通的重要前提。根據圖4的結果進一步分析，在本研究條件下，發現高產對氨基酸苯甲酸的調控組合多不包含P3啟動子，這個結果表明高強度表達未必有利于目標代謝物的積累，找到與目標代謝物相關的最佳表達組合才是提升目標產物的關鍵[20]。

2.3 不同發酵溫度對對氨基苯甲酸生產的影響

由于含有重組質粒的工程菌株在發酵過程容易出現質粒丟失引起產量減少，而且質粒丟失本身又與發酵溫度有關[21]，為了尋求產量與發酵溫度的關系，本研究探索了不同發酵溫度對對氨基苯甲酸生產的影響。在保持培養基、接種量相同的情況下，以不同溫度進行搖瓶發酵，分析了發酵24 h和48 h的對氨基苯甲酸生產情況，結果如圖5所示。通過24 h發酵，37 ℃發酵溫度可使對氨基苯甲酸生產積累較快，而30–35 ℃的發酵溫度則不同程度影響菌株生長，造成耗糖速率減緩，繼而導致對氨基苯甲酸積累量低于37 ℃發酵時的積累量。但是繼續發酵至48 h時，35 ℃發酵溫度獲得了最高的對氨基苯甲酸積累量，達到670 mg/L。因此，35 ℃是本實驗條件下最適合的對氨基苯甲酸發酵生產溫度。

圖4 不同強度啟動子組合調控對對氨基苯甲酸生產的影響

圖5 不同發酵溫度對對氨基苯甲酸生產的影響

2.4 對氨基酸苯甲酸分批補料發酵生產

在上述研究基因表達調控和發酵溫度影響對氨基苯甲酸生產的基礎上，本研究進一步進行了對氨基酸苯甲酸分批補料發酵生產研究。選擇35 ℃作為5 L罐的發酵溫度，分別以含有最優啟動子組合的弱化菌株和未弱化菌株進行對氨基酸苯甲酸分批補料發酵。分批補料發酵過程中采用前12 h溶氧與轉速聯動，以保證溶氧在30%左右； 12 h后根據溶氧情況逐漸提高轉速，把發酵液中的殘余葡萄糖濃度控制在5 g/L以下，以避免乙酸過多積累影響細胞生長和發酵生產[22]。采用上述分批補料發酵生產策略，2株大腸桿菌工程菌株的發酵生產過程如圖6所示。根據發酵結果，含有最優啟動子組合的弱化菌株最高可以積累6.4 g/L對氨基苯甲酸，而同樣條件下未弱化菌株最高只能積累1.95 g/L對氨基苯甲酸，前者比后者增加了約3.3倍。未弱化菌株可以積累高達約37 g/L的酪氨酸，而弱化菌株的酪氨酸積累量則大幅降低，最高只僅有8.76 g/L。因此，本研究也證實tyrA弱化調控策略可以大幅降低酪氨酸的積累。

圖6 大腸桿菌5L發酵罐分批補料發酵生產對氨基酸苯甲酸

3 討論

本研究從前期構建的生產3-脫氫莽草酸大腸桿菌工程菌株出發，通過基因表達調控和發酵優化，在大腸桿菌中顯著提升了對氨基苯甲酸的生物合成能力。對氨苯甲酸和酪氨酸的生物合成存在碳流競爭的問題(圖1)，但酪氨酸及其合成途徑中多個中間代謝產物是維持細胞生長所必需的。為了避免在發酵培養基中額外添加酪氨酸，本研究采用弱化碳流向酪氨酸分配的策略來調整碳流分配，期望更多的碳流向對氨基苯甲酸合成的方向。通過搖瓶發酵，尤其是5 L罐分批補料發酵生產研究表明，通過替換弱啟動子的方法有效地降低了酪氨酸的積累。當然，本研究目前沒能完全阻止酪氨酸積累，因此進一步的弱化策略仍然需要繼續研究。大量的代謝工程研究表明[20]，要提高目標產物的合成能力，控制途徑的代謝平衡，防止某個代謝中間產物過多積累是重要影響因素。目前的多個研究表明，組合表達調控是實現代謝平衡控制的重要策略[19]。本研究的對氨基苯甲酸合成途徑組合表達調控研究也證實這個結論。在本研究中和B基因表達量接近，并保持較低的表達水平(使用同樣強度的、表達量較低的啟動子)，同時控制基因的表達量略高于和B基因表達量，這樣的組合相對于其他組合能獲得較高的PABA積累量。而較高的和B基因表達水平(使用同樣強度的、表達量較高的啟動子) 則會降低對氨基苯甲酸的積累量。這個結果表明，對于代謝途徑關鍵酶，強表達能力反而不利于目標產物的高效合成。本研究的組合代謝調控策略不僅提高了大腸桿菌合成對氨基苯甲酸的能力，也為相關代謝工程的改造工作提供了重要參考。

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Improving the production of 4-aminobenzoic in engineeredby combinatorial regulation

Yicheng Xu1,2,3, Fuping Lu1,3, and Qinhong Wang2

1 Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China 2 CAS Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 3 College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China

Para-aminobenzoate (PABA) is an important chemical for organic synthesis and extensively used in pharmaceutical and dye industry. In recent years, PABA has

increasing attention as a potential component of high-strength polymer. In, three genes of,andare responsible for PABA production from chorismate in folate synthetic pathway. However,does not accumulate or accumulates very few amounts of PABA under normal growth condition. In this study, the tyrosine-producingTYR002 constructed previously was used as the starting strain for developing PABA-producing strain. First, the activity of bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydrogenase TyrA inTYR002 was weakened to reduce the production of tyrosine. Then, three different constitutive promoters were used to regulate the expression of,andin recombinant plasmid which was transformed intofor improving PABA production. The shake-flask fermentation showed that the different combination of constitutive promoters significantly affected the production of PABA, and the highest shake-flask fermentation titer was 0.67 g/L. After further condition optimization, the engineeredproduced 6.4 g/L PABA under 5 L fed-batch fermentation. This study could be a good reference for improving microbial production of PABA.

-aminobenzoate,, combinatorial regulation, metabolic engineering, folate synthetic pathway

March 22, 2019;

May 10, 2019

Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KFZD-SW-212-3-1), Research Equipment Program of Chinese Academy of Sciences (No. YJKYYQ201700233).

Qinhong Wang. Tel/Fax: +86-22-84861950; E-mail: wang_qh@tib.cas.cn

徐毅誠, 路福平, 王欽宏. 組合代謝調控提高大腸桿菌對氨基苯甲酸產量. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1650–1661.

Xu YC, Lu FP, Wang QH. Improving the production of 4-aminobenzoic in engineeredby combinatorial regulation. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1650–1661.

中國科學院重點部署項目 (No. KFZD-SW-212-3-1)，中國科學院科研儀器設備研制項目 (No. YJKYYQ201700233) 資助。

(本文責編 陳宏宇)