黑色素生成信號通路研究進展

趙美娟，戶晶晶，倪輝，姜澤東，王力

黑色素生成信號通路研究進展

趙美娟1,2，戶晶晶1,2，倪輝1,2，姜澤東1,2，王力1,2

1 集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021 2 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021

黑色素生成是一種在黑色素細胞中產生黑色素的生物合成途徑，涉及一系列復雜的酶催化和化學催化反應。主要有5條信號通路參與調控，其中小眼相關轉錄因子(Microphthalmia-associated transcription factor，MITF) 是各個通路的重要靶標。此外，許多細胞因子也參與調控黑色素生成，在黑色素細胞的發育、增殖、分化、遷移過程中發揮重要作用。結合課題組研究成果，發現多金屬氧酸鹽可作為一種潛在的黑色素抑制劑用于切斷黑色素生成途徑。因此，文中對黑色素生成信號通路作用機制進行綜述，并簡單介紹已報道的相關通路調控因子，以期有助于多金屬氧酸鹽在黑色素生成途徑中的應用研究。

黑色素生成，信號通路，小眼相關轉錄因子

類胡蘿卜素、血紅蛋白、氧合血紅蛋白、黑色素，人體內這4種發色團可決定皮膚顏色，其中黑色素是最主要的成分[1]。黑素體是黑色素生成的場所，位于表皮基層黑色素細胞內，黑色素生成后從黑色素細胞的樹突尖傳遞至角質形成細胞，該過程為黑色素生成過程[2]。人的頭發、眼睛、皮膚的顏色不僅依賴于黑色素的產生，黑色素的含量、分布以及類型也對其有影響，此外，黑色素細胞的數量、樹突程度、相關酶的活性和黑素體的轉移均會影響色素沉著[3]。黑色素可以保護皮膚免受紫外輻射、氧化壓力等環境污染因素帶來的有害影響，但是黑色素的過量累積會導致許多皮膚病的出現，例如雀斑、老年斑、黑皮病等。為了有效控制色素沉著，目前已經發現許多黑色素抑制劑并應用于化妝品以及皮膚病學治療藥物，本課題組長期致力于研究多金屬氧酸鹽對酪氨酸酶的抑制作用，但是具體的抑制機理尚不明確。本文綜述了黑色素生成的相關信號通路的研究進展，并結合課題組的研究，以期為多金屬氧酸鹽調控黑色素生成機制的進一步研究提供理論基礎。

1 黑色素的合成

黑素體是黑色素合成的特定場所，位于黑色素細胞內，黑色素細胞位于人體表皮基層，細胞表面有許多稱為dendrites樹突的突起。當黑色素細胞被紫外輻射等刺激時，黑色素細胞就在黑素體內合成黑色素，并通過樹突傳遞至角質形成細胞。黑色素包括真黑素和褐黑素，前者是一種棕黑色或深色不溶性聚合物，后者是一種紅黃色可溶性聚合物[4-5]。黑色素合成過程極其復雜，主要涉及酪氨酸酶基因家族中的3種酶，即酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)、酪氨酸酶相關蛋白1 (Tyrosinase-related protein-1，TRP-1)、酪氨酸酶相關蛋白2 (Tyrosinase-related protein-2，TRP-2)，這3種酶都是與膜結合的糖蛋白，其中酪氨酸酶是該反應的關鍵酶[4]。TYR參與了2種黑色素生成過程，而TRP-1、TRP-2在真黑素合成過程中發揮重要作用，TRP-1具有5,6-二羥基吲哚-2-羧酸(DHICA)氧化酶活性，TRP-2可以快速地將多巴色素轉化為DHICA[6]。

黑色素合成主要經歷兩個階段，第一階段是酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下生成L-二羥基苯丙氨酸多巴(L-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)，并在酪氨酸酶作用下進一步生成多巴醌(Dopaquinone，DQ)，或者是酪氨酸酶催化酪氨酸直接氧化生成多巴醌。該階段的反應是黑色素合成的關鍵步驟。多巴醌作為黑色素合成底物進入第二階段反應。第二階段又分為3個部分，當半胱氨酸或谷胱甘肽存在時，多巴醌與其反應生成半胱氨酰多巴或谷胱甘肽多巴，之后進一步氧化聚合生成褐黑素；當二者不存在時，多巴醌自身環化形成多巴色素，若多巴色素自發脫羧，形成5,6-二羥基吲哚(DHI)，在酪氨酸酶作用下進一步氧化聚合生成黑色素(DHI黑色素)；若多巴色素在TRP-2作用下發生互變異構現象轉化成DHICA，則在TRP-1作用下生成黑色素(DHICA黑色素)[7]。

2 黑色素形成的信號通路的調控

MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) 是一種堿性螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鏈轉錄因子，可以同啟動子區域的M-box基序(TYR、TRP-1、TRP-2在啟動子區域共享的一個高度保守序列，即5′-AGTCATGTGCT-3′) 結合之后調節TYR、TRP-1、TRP-2的表達，從而調控黑色素的生成[3]。MITF是多種信號傳導路徑的最終靶向目標，是黑色素生成的主要調節因子。黑色素生成涉及五大主要信號通路，除此之外還有一些比較少見的信號通路和其他途徑，以下將對其進行概述。文中將5條主要的信號通路匯總為一個整體，繪制的黑色素合成途徑如圖1所示。

圖1 黑色素合成途徑

2.1 MC1R/α-MSH信號通路

這個信號通路也稱為cAMP依賴性信號通路，主要是通過環磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A (PKA) 因子進行調控。黑皮質素1受體(MC1R)是一種七跨膜受體，可與Gas蛋白偶聯刺激腺苷酸環化酶(AC)，隨后產生cAMP[8]。PKA是cAMP的關鍵受體之一，cAMP是細胞內信號激活PKA的重要介質。在cAMP不存在的情況下，PKA全酶處于無活性狀態，其兩個催化亞基與兩個調節亞基結合，PKA的調節亞基有4種同種型(即RⅠα、RⅠβ、RⅡα、RⅡβ)，催化亞基有3種同種型(即Cα、Cβ、Cγ)。cAMP結合PKA的調節亞基并誘導催化亞基與全酶復合物的解離，并且釋放的催化亞基被激活，最終易位至細胞核并在Ser133處磷酸化激活cAMP反應元件結合蛋白(CREB)從而調節黑色素的合成，據報道，Ser133和Ser129被認定為CREB活化的主要磷酸位 點[9]。

太陽光的紫外波長分為3組：UVA (320–400 nm)、UVB (280–320 nm)、UVC (200–280 nm)，其中UVC被大氣中的臭氧層吸收，UVB輻射通過角質形成細胞和黑色素細胞的相互作用誘導黑色素的生成[10]。在哺乳動物中，UVB輻射刺激α-黑色素細胞刺激素(α-MSH) 產生，隨后α-MSH與黑色素細胞表面的MC1R結合激活AC，從而加速細胞內cAMP濃度增加，cAMP作為第二信使進一步激活PKA。PKA轉移至細胞核，在Ser133處刺激CREB磷酸化并結合CREB結合蛋白(CBP)，增加MITF的表達，促進黑色素生成相關酶TYR、TRP-1、TRP-2的表達進而調節黑色素的形成[11-12]。

Lee等報道，4-羥基-3-甲氧基肉桂醛(4H3MC) 可以作用于cAMP與PKA的結合位點，直接抑制cAMP誘導的PKA全酶的解離和活化進而抑制黑色素生成[5]。G蛋白偶聯雌激素受體(GPER) 是調節生理和紫外線誘導的黑色素生成的重要因子，通過cAMP-PKA通路上調TYR和MITF的表達，促進黑色素生成[13]。此外，甘露醇、白藜蘆醇、dehydroglyasperin C[2]、曲酸衍生物KAD2[14]、查爾酮-21[15]等都可通過調控該通路來調節黑色素生成。

2.2 PI3K/Akt信號通路

PKA是主要的cAMP細胞內靶標，但是cAMP也可以通過PKA非依賴性機制調節黑色素生成。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一種磷脂酰肌醇激酶，在肌醇環第3位羥基發生磷酸化作用，擁有磷脂酰肌醇激酶活性及絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。PI3K的關鍵效應物之一是蛋白激酶B(Akt)，在外界信號及細胞內cAMP的刺激下，PI3K被激活產生3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(PI-3,4-P2)和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PI-3,4,5-P3)這兩種類脂產物，該產物與Akt結合并在Akt的Thr308和Ser473位點磷酸化進而激活Akt[16]，其中Ser473位點的磷酸化作為Akt蛋白完全被激活的標 志[17]。活化的Akt在Ser9處磷酸化糖原合酶激酶3β(GSK3β)并促進其喪失活性，GSK3β活性的降低增強MITF與M-box的結合力。GSK3β既不調節MITF啟動子的活性，也不調節MITF的內在轉錄活性，但是會與MITF協同刺激酪氨酸酶啟動子，GSK3β使MITF的Ser298位點發生磷酸化作用，增強其與酪氨酸酶啟動子的結合進而調控黑色素生成[18]。

Ko等報道稱Eupafolin可抑制Akt，激活磷酸化ERK或p38 MAPK信號通路來抑制黑色素生成，它以濃度依賴性方式抑制細胞內TYR、TRP-1、TRP-2的合成，且研究表明，Akt抑制劑與Eupafolin共同作用的抑制效果更好[19]。白介素10(IL-10)可激活PI3K/Akt途徑和JAK/Stat3途徑，前者激活經典NF-κB途徑并滅活GSK-3β，進一步上調黑色素生成[20]。沒食子酸、橙皮苷、植物鞘氨醇等通過該通路調控黑色素生成過程也有相關報道。

2.3 MAPK信號通路

在表皮中，角質形成細胞響應包括衰老在內的各種刺激分泌大量細胞因子，稱為干細胞因子(SCF)，其在調節人黑色素細胞的生命周期以及其他因素中起關鍵作用。MAPK信號途徑中的激酶MEK和ERK涉及黑色素細胞受體的激活，配體通過與受體細胞外結構域結合激活復雜機制(Ras-Raf-MEK-ERK)，從而導致MITF上調[21]。當信號配體SCF與細胞表面上的c-Kit受體結合時，信號開始，其中Ras激活B-raf激酶，然后激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯。MAPK家族蛋白，包括細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38。ERK或JNK活化(即磷酸化)觸發MITF的表達，導致其降解并隨后下調黑色素生成。與該通路相反，ERK的激活可導致CREB的磷酸化，磷酸化的CREB與MITF啟動子區域的CRE共有基序結合以上調表達MITF基因。p38的磷酸化激活MITF表達，反過來上調黑色素生成相關蛋白，進而影響黑色素合成[11]。細胞內的cAMP含量升高也會激活ERK，導致MITF中Ser73位點直接磷酸化，或者通過激活核糖體S6激酶(RSK)間接磷酸化MITF中Ser409位點，導致磷酸化MITF被蛋白酶體降解[9]。

另外一個激活MAPK通路傳導的途徑是內皮素(EDN)與其受體的相互作用。EDN與其受體EDNRB(一種G蛋白偶聯受體)的相互作用是角質形成細胞和黑色素細胞之間關鍵的旁分泌相互作用之一[22]。在內皮素肽中，EDN-1(血管收縮肽)被認為是重要成員，首先從血管內皮細胞中分離出來。EDN-1與其受體結合可介導黑色素細胞增殖、黑色素生成、遷移等過程[23]。此外，最近的研究結果表明，由EDN-1引發的黑色素生成伴隨著MITF介導的糖蛋白跨膜途徑，該蛋白為非轉移性黑色素瘤蛋白b(GPNMB)，這是黑素體形成的關鍵因素。EDN-1與EDNRB結合并觸發多磷酰肌醇的水解，其通過活化的磷脂酶C的作用產生肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)，其分別聚集細胞內Ca2+并激活PKC。活化的PKC直接磷酸化RAF或RAF-1，進而導致MAPK級聯的激活[5,22]。

EDN-1和SCF之間存在細胞內信號的相互作用，它通過EDN-1誘導的PKC激活和SCF誘導的c-kit自身磷酸化(激活)之間的串擾協同刺激DNA和黑色素合成[24]。該過程啟動MAPK級聯以進一步作用于黑色素生成的下游途徑。

目前已有許多抑制劑被證實是通過調控該通路來影響黑色素生成的，例如，IBMX以計量依賴性方式減弱MEK/ERK和PI3K/Akt信號分子磷酸化，下調TYR、TRP-1、TRP-2、MITF及其上游轉錄因子CREB[25]。研究表明，白藜蘆醇處理HT-144細胞可使其以濃度依賴性抑制其增殖，通過調控MEK/ERK通路加強CREB的表達[26]。槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(QCGG)通過細胞外信號相關蛋白激酶(ERK)激活，降低酪氨酸和酪氨酸相關蛋白的表達，隨后下調CREB、p38和MITF，從而減少黑色素合成[1]等。

2.4 Wnt/β-catenin信號通路

Wnts是富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，在胚胎發育過程中具有重要功能，特別是神經嵴細胞。Wnt信號通路影響細胞命運、增殖、分化及遷移[27]。Wnt蛋白調節的信號通路包括經典通路(β-catenin依賴性通路)和非經典通路(β-catenin非依賴性通路)。Wnt蛋白與Frizzled家族的七跨膜受體及低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP-5/6)結合，進而激活Wnt信號傳導途徑[28]。Wnt1/3A/7/8/8B等配體可激活經典Wnt信號傳導，Wnt4/5A/5B/11等配體可激活非經典路徑。非經典信號傳導具有多樣性，以黑色素瘤細胞為例，Wnt5A和Wnt3A配體競爭性結合Fzd2受體，進而阻止LRP6和β-catenin的積累[29]。Ca2+、平面細胞極性通路等途徑也可介導非經典通路。經典途徑依賴于β-catenin，在Wnt經典途徑未激活時，β-catenin被Gsk3β在Tyr216磷酸化而使其泛素化降解。Wnt蛋白質與G蛋白偶聯受體(Frizzled)結合激活經典途徑，導致GSK3β失活(在Ser21/9磷酸化)，隨后β-catenin在細胞質中積累并易位至細胞核。在細胞核內，β-catenin與淋巴增強因子-T細胞因子(LET-TCF)形成復合物增加MITF基因的表達，核β-catenin水平升高可增加MITF的表達，從而增加黑色素瘤細胞的存活和增殖，刺激黑色素生成[27,30]。

P21激活的激酶4(PAK4)是CREB的關鍵調節因子，作用于MITF上游，激活的PAK4通過兩種不同的信號途徑促進黑色素生成：CREB/ MITF/酪氨酸酶和β-catenin/MITF信號途徑。PAK4可通過雙重機制穩定β-catenin，一是直接增強Ser675位點的β-catenin磷酸化，抑制其降解；二是在S33/37阻斷β-catenin的磷酸化，這是泛素化依賴性降解的指標[10]。柚皮素在體外系統中沒有直接調節酪氨酸酶活性，但是在B16-F10細胞中可通過激活PI3K/Akt或Wnt/β-catenin信 號通路，刺激其細胞內酪氨酸酶活性[27]。凡是 對該通路中所涉及因子有影響的物質均可能會 影響其信號傳導，從而起到調節黑色素生成的 作用。

2.5 NO信號通路

NO是一種可擴散的自由基，在多種細胞和組織中具有多效的生物調節作用。黑色素細胞和角質形成細胞響應炎性細胞因子產生NO，角質形成細胞中NO的產生是由紫外輻射引起的。通過激活第二信使，NO增加酪氨酸酶活性和黑色素生成，因此是影響黑色素生成的自分泌和旁分泌分子[31]。可溶性鳥苷酸環化酶(sGC)是NO的主要受體，一旦由角質形成細胞產生，NO直接與含有血紅素的蛋白質sGC結合使其活性增加，進而催化GTP轉化為細胞內第二信使環磷酸鳥苷(cGMP)，因此導致MITF表達和黑色素生成[32]。而且細胞內cGMP水平還可影響蛋白激酶G(PKG)的活性，這種酶磷酸化可激活另一種促進酪氨酸酶表達的轉錄因子——蛋白1，進而調節黑色素的生成[4]。

通過cGMP途徑增強酪氨酸酶基因表達可能是NO誘導的黑色素生成的主要機制。但它還可能參與酪氨酸酶mRNA的誘導，在氧氣存在時NO與黑色素相關的代謝物DHICA反應，導致黑色素樣色素的沉積。除此之外，NO還對其他信號通路有影響，有研究表明，NO途徑可提高MC1R的表達并刺激α-MSH的分泌以增強黑色素生成的α-MSH途徑[33]。

2.6 黑素體轉移機制

黑素體形成是黑化過程中的關鍵步驟，但黑素體必須從黑色素細胞轉移到角質形成細胞才能促進黑色素的生成。蛋白酶激活受體(PAR)-2通過增加角質形成細胞對黑素體的吞噬作用誘導黑素體轉移，紫外輻射可刺激PAR-2表達，進而誘導黑素體轉移[34]。絲氨酸蛋白酶的抑制已經顯示導致角質形成細胞中蛋白酶激活受體2的活化受損，進而導致黑色素細胞內黑素體的積累。這種受體的抑制阻斷了這些細胞之間的黑素體轉移，因此也阻止了這種細胞的分散。這表明通過抑制角質形成細胞受體-蛋白酶激活受體2是一種調節色素沉著的潛在機制[35]。

在體外模型中還證明，黑色素細胞和角質形成細胞膜上的糖基化殘基對于受體介導的內吞作用是關鍵的，因此促進黑素體轉移。凝集素和新糖蛋白也被證明可以抑制黑素體轉移[36]。

2.7 調節黑色素生成的其他途徑

上述的途徑是調控黑色素生成的主要信號通路，此外還有其他途徑也可參與黑色素生成，例如，MHY884是一種酪氨酸酶抑制劑，可在Thr23位點抑制Akt活化及Akt介導的IKK磷酸化，減弱UVB誘導的氧化應激，導致NF-κB活性降低，進而調控黑色素生成[37]。Incontinentia pigmenti (IP)和Ectodermal dysplasia (ED) 在NF-κB信號傳導中表達缺陷而使皮膚色素沉著異常。此外，一些細胞因子在黑色素細胞增殖、分化、黑色素生成中發揮重要作用，比如，轉化生長因子β (TGF-β)，一種角質形成細胞衍生因子，在沒有紫外線照射時，通過誘導Smad信號而抑制Pax3 (The paired box 3，配對盒3) 的褪黑細胞分化；紫外線照射激活Jun N-末端激酶激活蛋白1通路而抑制TGF-β在角質形成細胞內的產量，最終導致黑色素的生成。骨形態遺傳細胞(BMP) 是TGF-β家族的重要成員，其中，BMP2、BMP6可通過調節酪氨酸酶而增加黑色素生成，BMP4則抑制黑色素生成。基本成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF) 等細胞因子也會參與調控黑色素生成[38]。Pax3、Sox10可通過激活MITF的表達而調節黑色素生成。Omeprazole通過抑制ATP7A蛋白的金屬化來增加其降解，從而抑制新合成的TYR活性。咖啡酸苯乙酯(CAPEE) 可抑制MITF與M-box的結合而降低相關蛋白TYR、TRP-1、TRP-2的表達，但不會影響MITF的表達[11]。

3 多金屬氧酸鹽對酪氨酸酶的抑制

集美大學王力教授所在的多酸課題組致力于多酸在酶學領域的研究，近年來，主要圍繞Keggin型和Dawson型兩種結構的多酸，利用酶動力學分析研究其對酪氨酸酶的抑制類型及抑制機理。研究表明，兩種結構的多酸對酪氨酸酶均有抑制作用。研究成果如表1[39]所示。Xing等[42]通過細胞實驗發現，Keggin型多酸Na7PMo11CuO40雖然在低濃度下對酪氨酸酶的抑制效果不顯著，但是細胞內黑色素含量卻顯著降低，且細胞毒性較低，說明該化合物可作為一種潛在的黑色素生成抑制劑，并且可能不是通過直接抑制酪氨酸酶活性而起作用的，但其中涉及的具體機制尚待研究。隨著課題組在多酸作為酶抑制劑用于調控黑色素生成途徑的深入研究，未來在基因調控、信號通路方面研究將成為新的方向。

表1 合成化合物對酪氨酸酶的抑制效果[39]

4 總結與展望

黑色素可對皮膚起到保護作用，過少防護作用減弱，過多則引發許多皮膚疾病，近年來，調控黑色素逐漸成為研究熱點。目前已經發現許多物質可調節黑色素的生成，但是大部分物質具有細胞毒性，無法應用于化妝品、藥品中，且作用效果不顯著。因此，研究開發高效、低毒性、副作用小的黑色素調控劑成為未來的研究趨勢。結合課題組的研究成果，發現多金屬氧酸鹽對酪氨酸酶具有顯著的抑制效果，且根據Xing等的細胞實驗，發現多酸可作為一種潛在的黑色素生成抑制劑[42]，但調控黑色素生成的具體機制尚未研究，因此，課題組接下來將會從信號通路、基因調控方面深入研究多金屬氧酸鹽對黑色素生成的調節機制，以期研制新型黑色素生成調控劑并可應用于化妝品、藥品中，為皮膚美白、皮膚病學治療提供新方向。

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Research progress in melanogenesis signaling pathway

Meijuan Zhao1,2, Jingjing Hu1,2, Hui Ni1,2, Zedong Jiang1,2, and Li Wang1,2

1 College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, Fujian, China 2 Fujian Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering, Xiamen 361021, Fujian, China

Melanogenesis is a biosynthetic pathway to produce melanin pigment in melanocyte, involving a series of intricate enzymatic and chemical catalyzed reactions. Melanogenesis involves five signaling pathways that converge on microphthalmia-associated transcription factor. In addition, many cytokines, involved in the regulation of melanogenesis, play an important role in the development, proliferation, differentiation and migration of melanocytes. Polyoxometalate can be used as a potential inhibitor of melanin production. Hence, this paper reviews the signaling pathways of melanogenesis and their regulatory mechanism, to apply polyoxometalates in the melanin production pathway, and briefly introduces the regulatory factors of related pathways.

melanogenesis, signal pathway, microphthalmia-associated transcription factor

March 4, 2019;

June 24, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 21871110), Fujian Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering (No. B19097-12).

Li Wang. Tel: +86-592-6181774; E-mail: wanglimerry@jmu.edu.cn

國家自然科學基金(No. 21871110)，福建省食品微生物與酶工程重點實驗室項目 (No. B19097-12) 資助。

2019-07-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190718.1619.002.html

趙美娟, 戶晶晶, 倪輝, 等. 黑色素生成信號通路研究進展. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1633–1642.

Zhao MJ, Hu JJ, Ni H, et al. Research progress in melanogenesis signaling pathway. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1633–1642.

(本文責編 郝麗芳)