原位顯微鏡在細胞生物量在線監測中的發展與應用

王遠山，郝文輝，吳哲明，牛坤，龔美華

原位顯微鏡在細胞生物量在線監測中的發展與應用

王遠山，郝文輝，吳哲明，牛坤，龔美華

浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014

隨著現代生物技術的快速發展，生物發酵過程在工業生產中的重要性日益增加。為獲得質量穩定的發酵產品，通常需要對發酵過程進行監測與調控。生物量可以直接反映生物反應器中細胞代謝的主體——細胞的生長狀況，因此實現生物量的在線監測對發酵過程的調控具有重要意義。原位顯微鏡是一項非侵入式的、基于圖像分析的技術，可以實時監測生物過程中的細胞量。文中就原位顯微鏡的發展及其在細胞生物量實時監測中的應用進行了綜述。

原位顯微鏡，發酵過程，生物量，在線監測

隨著近幾十年生物技術的迅猛發展，生物發酵已經廣泛應用于食品、制藥、環境保護、能源等行業中[1]，酸奶、啤酒、生物乙醇、抗生素、氨基酸、單克隆抗體等發酵產品層出不窮，生物發酵已與人們的生活息息相關。發酵過程的高效調控是確保生物發酵產品產量與質量的關鍵。截至目前，多種傳感器已被開發用于監測發酵過程中的一些重要參數，比如pH、溶氧、溫度、底物濃度、產物濃度、呼吸商、生物量等[2]，為發酵過程的實時調控提供切實可靠的數據，保障產品的最終產量與質量。

在發酵過程中，通過活體細胞代謝將底物轉化為產物是生物反應過程中的關鍵，因此對生物量的監測，尤其是對活細胞生物量的監測就顯得尤為重要[3-5]。生物量是指單位體積培養基中所含細胞的質量或細胞的數目[6]。通過對生物量的監測，可以對發酵過程中細胞的生長狀態進行評估，從而采取合適的調控策略，以保證發酵過程的正常運行。目前關于生物量監測的主流方法多是采用離線的方式來進行，如干重法、光密度法 (600)、計數法、離心體積法等，雖然這些方法操作簡單、成本低廉，但是過程繁瑣、耗時費力，對培養液中的活細胞、死細胞以及不溶性物料無法區分，更重要的是不能實時反映生物量，使得對發酵過程的調控具有嚴重的滯后性[7-10]，并且頻繁的取樣過程會使得發酵罐中的培養體系發生改變，增加染菌的風險[11]。除了生物量的監測之外，對細胞的活力鑒定也極為重要。通常，根據原理，細胞活力鑒定可以分為如下幾類[12-19]：第1類是基于細胞在固體平板上生長的能力；第2類是基于細胞膜的完整性；第3類是基于細胞膜的功能性；第4類是基于細胞中的某些酶的活性；第5類是基于流式細胞儀的篩選鑒定。這些方法對發酵過程的調控同樣具有滯后性。為了克服檢測滯后性，學者們做了大量工作，開發了熒光法、電容法和原位顯微鏡、近紅外光譜、激光反射光譜、拉曼光譜等多種在線監測技術[1,20-27]。

熒光法是通過熒光傳感器對細胞中自發熒光基團，如NADPH，或者與熒光試劑相絡合的基團進行監測，收集熒光信號，構建多元線性回歸模型和偏最小二乘 (Partial least squares, PLS) 回歸模型，對發酵過程中的生物量濃度、底物濃度等發酵參數進行在線監測[28]。熒光傳感器種類繁多，有二維熒光傳感器、多維熒光傳感器等。Haack等[28]利用多維熒光傳感器對釀酒酵母細胞生物量濃度進行了在線監測，Hantelmann等[24]將二維熒光傳感器應用于釀酒酵母的分批發酵。然而熒光法是基于細胞中自發熒光基團或者需要向培養基中添加熒光試劑，并且在監測過程中存在熒光信號重疊問題，使得熒光法在活細胞生物量在線監測過程中難以實施[24]。

電容法是基于在交變電場中具有完整生物膜的細胞會發生極化，通過測定發酵液在一定頻率范圍內的電容和電導率來衡量發酵液中的生物量濃度[7]。生物反應器中的發酵液可以視為由3個獨立的部分組成，分別為細胞質、外部質膜、懸浮介質。細胞質是由內部細胞器和蛋白質、核酸以及小分子物質組成的高度復雜的混合物；質膜是細胞導電的核心，其本身不能導電；懸浮介質由水和帶電離子基團組成。因此，可以將發酵液視為包含眾多球形電容器的懸浮液[29]。向發酵液施加一個交變電場，使細胞內部和外部帶正電荷的離子和帶負電荷的離子向相反的方向移動，直至遇到質膜，帶正電荷的離子與帶負電荷的離子分別聚集在細胞膜的兩側，導致細胞發生極化。這種由電場所引起的細胞極化的量級可以通過電容來進行測量，進而對發酵液中生物量濃度進行監測。Lan等[30]將電容法應用于真氧產堿桿菌發酵聚羥基鏈烷酸酯過程中的活細胞量檢測；Xiong等[31]在釀酒酵母高密度分批補料發酵谷胱甘肽中利用電容法測定發酵液中的活細胞生物量濃度。盡管存在一些不足，如價格昂貴、細胞質中的膜結構對整個細胞的介電性質產生影響，同時電極的極化使得整體的電容測量偏大等[21]，電容法仍然是應用最為廣泛的活細胞生物量在線監測方法。華東理工大學生物反應器國家重點實驗室等研究機構在這方面做了大量工作，在發酵過程控制與優化方面也取得了良好的效果[27,30-31]。

原位顯微鏡技術是基于在線采集生物反應器中發酵液的顯微圖片，通過對顯微圖片的處理分析，在線獲取發酵液中的生物量濃度，并對細胞形態進行分析[32]，目前已成為一種具有較好應用前景的在線生物量分析技術。

筆者所在團隊長期從事工業生物技術領域的研究，其中涉及到大量的微生物發酵和細胞培養過程，對過程控制與優化有著較好的積累，深知細胞生物量和形態在線檢測的重要性。同時，筆者及所在團隊也承擔了生物工程專業主干課程生物工程設備 (國家精品資源共享課程http://www. icourses.cn/sCourse/course_2616.html) 的教學工作，生物培養過程的檢測與控制是教學重要內容，因而對生物量在線檢測技術也有較好的了解。鑒于目前在國內還沒有系統介紹原位顯微鏡發展及其應用的文獻，本文結合筆者科研和教學工作的積累就此進行綜述。

1 原位顯微鏡的結構

1990年，Suhr等首次描述了原位顯微鏡的概念。它由顯微成像系統、控制系統、圖像處理系統3部分組成[33]，其結構示意圖如圖1所示[43]，具體描述將在下文展開。根據原位顯微鏡在發酵過程中對樣本量的定義方式，可以將其劃分為兩類：一類是光學采樣原位顯微鏡，通過估計顯微照片的景深來定義虛擬的樣本量。第二類是機械采樣原位顯微鏡，通過機械裝置重復封裝體積相等的樣品來定義樣本量[6]。對于光學采樣原位顯微鏡因其需要從顯微照片中計算景深，所以其算法結構相對于機械采樣原位顯微鏡要更復雜。而對于機械采樣原位顯微鏡，其機械裝置和命令系統更復雜。

1.1 光學采樣原位顯微鏡

1995年，Suhr等第一次詳細描述了光學采樣原位顯微鏡，其結構簡圖如圖2所示[6]。一個直徑為25 mm的不銹鋼外管安裝在生物反應器上，其末端是一個密封的透明石英玻璃窗，作為隔絕發酵罐內部環境與外部環境的屏障，從而保障發酵罐內部的無菌環境。一個直射光顯微鏡集成在不銹鋼內管中，在發酵時將內管插入到外管中，與SIT照相機一起組成顯微成像系統。發酵結束后可以將內管從外管中取出單獨保存。

圖2 光學采樣原位顯微鏡[6]

顯微鏡由物鏡 (Olympus D APO l00×UV，油浸，NA=0.95)、二向色鏡以及外耦合鏡組成，并且可以通過調節千分尺螺旋來實現顯微鏡的正確聚焦。氮激光光源發射波長為337 nm的光，經過二向色鏡反射后，照亮細胞。隨后被照射的細胞激發出450 nm波長的熒光，透過二向色鏡，經過外耦合鏡，將細胞的圖像呈遞給照相機記錄。之后顯微照片傳輸至搭載了圖像分析算法的電腦中被儲存和分析。在發酵開始的階段，圖像獲取的頻率為每2秒一張圖像，到了后期頻率變為每20秒一張圖像。圖像的處理速度為每分鐘一張。顯然圖像的分析速度慢，無法為發酵過程調控提供大量實時的具有統計學意義的數據。

Camisard等[34]、Wiedemann等[35]對Suhr等開發的光學采樣原位顯微鏡進行了改進。他們以發光二極管 (LED) 作為光源，通過光纖傳導，照亮物鏡前的區域。在纖維末端和石英玻璃窗之間，存在0.7 mm的間隙，允許發酵液自由流動。此外，圖像獲取頻率和圖像處理的速度也得到了極大的發展。在Camisard等開發的算法中，圖像處理速度達到了0.6 s/張[34]。目前市場上光學采樣顯微鏡結構簡圖和實物圖如圖3所示[36,41]。

1.2 機械采樣原位顯微鏡

1998年，Bittner等[33]基于光學采樣原位顯微鏡開發了機械采樣原位顯微鏡，其結構簡圖如圖4所示[38,45]。安裝在發酵罐的前端具有透明石英窗的不銹鋼外管，可以自由移動帶有直射光顯微鏡的內管，一個CCD照相機組成顯微成像系統。在不銹鋼外管的前端有可以自由滑動的密封的照明系統，由一個滑塊、聚光器、發光二極管組成。采樣時，電機驅動照明系統向外管的前端滑動，從而與外管共同組成體積固定的樣品小室。在這個封閉的小室中完成樣品的顯微成像后，照明系統回到原位，樣品小室重新打開，封裝的樣品被釋放，發酵液可以自由地通過采樣區。

2007年，Wei等[38]在機械采樣原位顯微鏡的基礎上對照明系統進行改進，開發出了暗場原位顯微鏡。在暗場顯微鏡中，正常的聚光器被暗場聚光器所取代，這樣可以使顯微照片的背景變得更暗，目標細胞變得更亮，從而增加照片的清晰度，有利于后續的細胞識別，其照明原理如圖5所示[39]。準直透鏡將LED光源發射的光整合成平行光，位于準直透鏡與石英玻璃窗中間的暗場聚光器對中間部分的平行光進行限制，同時改變邊緣部分平行光的路徑，使其投射于采樣區的細胞。從而光源發射出的光無法進入物鏡，而被照亮的細胞發出的散射光被物鏡收集，從而將細胞的圖像呈遞給照相機記錄。同時，在物鏡與相機之間添加一個中繼透鏡，通過中繼透鏡的二次成像，可以使照相機記錄的顯微照片更清晰，有中繼透鏡和無中繼透鏡拍攝的圖像如圖6所示[39]。

圖5 暗場照明原理[39]

2 圖像處理和分析

對圖像的處理和分析是原位顯微鏡技術應用的關鍵環節。近幾十年來，隨著人工智能的發展，應用于圖像處理和分析的軟件及算法越來越完善。盡管針對不同的發酵條件，其圖像處理的過程不盡相同，但是可以將其劃分為3個部分[33]。首先是圖像預處理，其目的是消除圖像捕獲期間的所有背景噪聲并增加細胞和背景之間的對比度。其次是細胞識別，這也是圖像處理過程中最核心的步驟，它的目的是將細胞像素從背景中的非細胞像素中識別和分離出來，因此如何正確識別細胞像素對于算法是至關重要的，在下文將詳細介紹。最后是細胞表征，通過從顯微照片中分離出的細胞像素來估計細胞的直徑、形態和大小，從而對細胞的活力進行表征。

對于一個算法的優良性，可以用靈敏度(Sensitivity,) 和正向預測值 (Positive predictive value,) 來進行評估[38,40]，其中靈敏度 () 表示算法能夠正確識別細胞的比例；正向預測值 () 表示算法檢測到的細胞是真實細胞的比例。高的靈敏度和正向預測值可以保證通過算法得到的數據的真實性和可靠性。用于細胞生物量和細胞活力表征的圖像處理技術將在后文中分別進行敘述。此外，圖像的處理速度也是至關重要的，因為在監測過程中會產生大量的顯微照片，處理速度慢就無法提供具有統計學意義的數據來實現在線監測。在初期，Suhr等[6]使用的圖像處理器的處理速度為每分鐘一張圖像。2017年，Belini等[41]使用WiT和MATLAB對顯微照片進行處理，其速度為每秒6張圖像，提高了360倍。

2.1 細胞生物量檢測的圖像分析

1995年，在Scholz等[42]開發的算法中，包含有5個步驟，分別為：1) 背景消除；2) 平滑；3) 生成模糊敏感特征向量；4) 確定景深；5) 計算濃度。雖然它可以對發酵液中的細胞生物量進行檢測和計算，但是不能提供關于細胞的特定信息，而且圖像處理速度很慢。隨后，1998年Bittner等[33]基于機械采樣原位顯微鏡開發出比較復雜的算法，同時利用釀酒酵母的光學特性即酵母細胞的細胞質具有比發酵液更高的折射率來提高算法的準確性。作者使用兩臺CCD相機分別記錄聚焦細胞和離焦細胞，其中離焦細胞用于細胞定位，而聚焦細胞用于細胞像素與背景中的非細胞像素分離。細胞識別后，使用中值濾波對圖像進行進一步降噪處理從而表征細胞形態，并且構建三維模型用于計算細胞體積。其圖像分析過程如圖7所示[33]。

2016年，Dias等[43]利用Matlab8.1運行圖像處理算法對廢水中的絲狀細菌進行在線監測，圖像經過預處理、二值化、菌絲鑒定后實現菌絲長度的量化，其中菌絲鑒定的過程如圖8[43]所示。同年，為了實現對畢赤酵母高濃度發酵過程的在線監測，Marquard等[44]采用兩種算法對圖像進行分析。在發酵過程的初始階段，發酵液中的細胞濃度低，作者使用畢赤酵母計數算法 (counter algorithm, PCA) 對發酵液中的細胞進行監測。之后經過指數期，細胞生長進入到穩定期，發酵液當中的細胞濃度很高并且聚集形成塊狀，此時通過PCA無法獲得發酵液中的細胞濃度，而聚類識別算法 (Cluster recognition algorithm, CRA) 可以解決這個問題，即通過計算塊狀的體積來建立與細胞濃度之間的關系。2017年，Belini等[41]利用WiT和MATLAB分析酵母細胞的原位顯微圖像，利用圓形霍夫轉化 (Circular hough transform, CHT) 對近似圓形的酵母細胞進行在線監測。此外還報道，利用原位顯微鏡與光纖pO2傳感器、中紅外光譜以及三維全息技術協同工作，監測乙醇發酵過程中細胞密度、葡萄糖、乙醇等的變化[45-47]。

圖7 原位顯微鏡圖像分析過程[33]

圖8 菌絲鑒定過程[43]

2.2 細胞活力表征的圖像分析

2007年，在支持向量機 (Support vector machine, SVM) 的幫助下，Wei等[38]在沒有使用任何染料的條件下實現了細胞的生物量檢測和細胞的活力鑒定。用兩個不同的實驗組對支持向量機 (SVM) 進行訓練，第一個實驗組的細胞處于對數期，第二個實驗組為死細胞。遺憾的是，細胞活力分類是在離線裝置中進行的，無法在發酵過程中進行實時監控。2010年，Burgemeister等[40]采用相同的方法，在腺病毒EI基因改造的人神經細胞系AGEI.HN培養過程中，利用CellViCAM算法對細胞的生物量和細胞的活力進行鑒定。該算法分兩步進行：首先，在圖像經過預處理后，利用CHT對圖像中的細胞像素進行定位；其次，利用已經建立好的4套訓練集，分別為活細胞訓練集、壞死細胞訓練集、早期凋亡細胞訓練集、晚期凋亡細胞訓練集對SVM分類器進行訓練。同時，應用3級樹狀分類架構，用于區分顯微照片中相應的4個細胞狀態。然而，使用細胞匹配和圓形相似性對細胞活力進行的鑒定僅限于具有規則細胞形態的細胞。

除了機器學習方法之外，還可以基于不同的細胞形態對細胞活力進行鑒定，在細胞生長最后階段，細胞形態的異質性就會表現出來。圖9展示了處于生長期和死亡期的哺乳動物細胞形態[35]。通過對細胞形態的異質性進行表征，實現細胞的活力鑒定。2011年，Wiedemann等[35]基于顯微圖像細胞像素灰度值的信息熵方差和對比度差異，對雜交瘤細胞的活力進行鑒定。旨在獲得單細胞的熵信息并計算低熵細胞的百分比，其中低熵意味著均勻的細胞形態，高熵意味著不均勻的細胞形態。2018年，Marbà-Ardébol等[48]基于非芽殖和芽殖細胞的不同形態，對酵母細胞活力進行鑒定，圖10展示了酵母細胞在芽殖過程中的形態異質性變化[48]。利用人工神經網絡 (Artificial neural networks, ANN) 將顯微圖像中的細胞像素分為出芽細胞和非出芽細胞，同時采用訓練的貝葉斯分類器對結果進行驗證。最后，根據鑒定結果計算出芽指數，從而判定酵母細胞的活力。

圖10 原位顯微鏡下酵母細胞的芽殖過程[48]

3 原位顯微鏡的應用

原位顯微鏡多應用于酵母細胞以及動物細胞的生化反應過程中，僅有少量文獻報道其在絲狀細菌、大腸桿菌以及藻類中的應用。

3.1 在酵母菌培養過程中的應用

1995年Suhr等[6]應用光學采樣原位顯微鏡對釀酒酵母的發酵過程進行監控。1998年Bittner等[33]同樣將機械采樣原位顯微鏡應用于釀酒酵母的發酵過程，此后Wei等[38]開發出暗場顯微鏡并且嘗試對釀酒酵母的活力進行鑒定；Marquard等[44]應用不同的算法嘗試將原位顯微鏡應用于巴氏畢赤酵母的高密度發酵過程；Belini等[41]將原位顯微鏡應用于生物乙醇的工業生產中；Marbà-Ardébol等[48]利用原位顯微鏡來計算釀酒酵母細胞的出芽指數從而判定細胞的活力。表1匯總了原位顯微鏡技術在酵母菌培養過程中的應用情況。由表1可知，原位顯微鏡在酵母細胞的生物發酵過程中應用前景廣泛。無論是高密度發酵還是工業生產，都實現了原位顯微鏡的在線監測，并且在線監測數據穩定，與離線方法的相關系數達到0.9以上。

3.2 在動物細胞培養過程中的應用

原位顯微鏡在動物細胞中的應用相對較晚，直到2002年，Joeris等[49]利用機械采樣原位顯微鏡對CHO細胞進行在線監測，2004年，Guez等[50]利用原位顯微鏡對雜交瘤細胞的高密度發酵進行在線監控。此后，Rudolph等[37]首次將原位顯微鏡應用于貼壁生長的小鼠成纖維細胞中，首先基于顯微圖像開發出一種算法，分割微載體與細胞；其次基于神經網絡算法估測微載體的分段圖像區域的電鍍效率和細胞定植水平；2010年，Burgemeister等[40]基于CellViCAM算法以及半自動支持向量機 (SVM)訓練，利用暗場顯微鏡對腺病毒EI基因改造的人神經細胞系AGEI.HN進行在線監測，其算法識別細胞的準確率達到86%，對細胞活力鑒定的準確性達到了87%。因支持向量機不是完全自動，2011年Wiedemann等[35]通過計算顯微照片中高熵細胞的比例判定細胞的活力。此后Lüder等[46]將原位顯微鏡與中紅外光譜連用，監測CHO細胞系的發酵過程。表2匯總了原位顯微鏡技術在動物細胞培養過程中的應用情況。由表2可知，在動物細胞的發酵過程中原位顯微鏡是一種有力的在線監測工具，其準確性高，并且與離線方法能夠良好擬合。

3.3 在其他細胞培養中的應用

截至目前，原位顯微鏡多用于近圓形細胞的發酵過程中，在其他形態細胞中僅有少量文獻報道。2016年Dias等[43]利用原位顯微鏡技術量化絲狀細菌的菌絲長度；2017年Marquard等[51]利用原位顯微鏡對大腸桿菌的發酵過程進行監控；同年Marbà-Ardébol等[47]利用原位顯微鏡與三維全息圖像技術對寇氏隱甲藻細胞中的脂質積累進行監測。表3匯總了原位顯微鏡技術在其他細胞培養過程中的應用情況。

表1 原位顯微鏡在酵母培養中的應用

表2 原位顯微鏡在動物細胞培養中的應用

表3 原位顯微鏡在其他細胞培養中的應用

4 總結與展望

綜上所述，原位顯微鏡是生物量濃度和細胞活力鑒定的有效工具，其非侵入性和非破壞性操作對于現代生物發酵至關重要。原位顯微鏡的研發主要集中于機械設備研制和算法優化及軟件的研發。鑒于原位顯微鏡主要用于動物細胞和酵母等近圓形細胞的培養過程，為拓展其應用范圍，可以從以下幾個方面著手：1) 對原位顯微鏡的硬件設施進行改進，如添加透鏡、改進照明方式等，以獲得更加清晰的顯微照片。2) 對原位顯微鏡的軟件進行研發，開發新的圖像處理技術和算法，提高識別效果和圖像處理速度，使得原位顯微鏡能夠應用于更多發酵過程和更加復雜的發酵環境。3) 增加原位顯微鏡的放大倍數，以便更多應用于細菌發酵過程。隨著這些新技術的開發，可以有效促進原位顯微鏡技術的應用，為生物量和細胞形態等的在線監測提供有效的工具，對發酵過程的高效調控具有一定意義。

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Development and application ofmicroscopy in on-line monitoring of cell biomass

Yuanshan Wang, Wenhui Hao, Zheming Wu, Kun Niu, and Meihua Gong

College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou310014, Zhejiang, China

With the rapid development of modern biotechnology, fermentation process is increasingly important in industrial production. To guarantee the stability of products, fermentation process should be elaborately monitored and controlled. Biomass is an important parameter for on-line monitoring in bioprocesses because biomass can reflect cell growth in a bioreactor directly.microscope, a non-invasive and image-analysis based technology, can real-time monitor cells in biological process. This review summarizes the development and application ofmicroscopy in biomass monitoring.

microscope (ISM), fermentation process, biomass, on-line monitor

January 31, 2019;

April 25, 2019

The High Education Teaching Reform Project of Zhejiang (No. jg0160030), Bioprocessing Equipment National Excellent Resources Sharing Curriculum (No. 2016-54), Bioprocessing Equipment Core Curriculum of Zhejiang University of Technology (No. 2016-69).

Yuanshan Wang. Tel: +86-571-88320391; E-mail: yuanshan@ziut.edu.cn

王遠山, 郝文輝, 吳哲明, 等. 原位顯微鏡在細胞生物量在線監測中的發展與應用. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1607–1618.

Wang YS, Hao WH, Wu ZM, et al. Development and application ofmicroscopy in on-line monitoring of cell biomass. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1607–1618.

浙江省高等教育教學改革項目 (No. jg0160030)，生物工程設備國家精品資源共享課程建設計劃 (No. 2016-54)，浙江工業大學生物工程設備專業核心課程建設計劃 (No. 2016-69) 資助。

(本文責編 郝麗芳)