人參皂苷單體定向轉化的生物催化及應用進展

李偉娜，蔣云云，劉彥楠，李春英，范代娣

人參皂苷單體定向轉化的生物催化及應用進展

李偉娜1,2，蔣云云1,2，劉彥楠1,2，李春英1,2，范代娣1,2

1 西北大學 化工學院 陜西省可降解生物醫用材料重點實驗室，陜西 西安 710069 2 西北大學 化工學院 陜西省生物材料與發酵工程技術研究中心，陜西 西安 710069

人參是我國傳統中藥，藥效顯著、應用廣泛。通過定向修飾與轉化人參皂苷糖基可產生高抗癌活性稀有人參皂苷。傳統化學法由于制備工藝極其復雜、成本過高，不能應用于臨床，微生物及其酶系轉化成為解決該瓶頸問題的最可行手段。有關全細胞催化、糖苷酶重組表達、固定化及其催化分子識別機制和溶劑工程的生物轉化已有大量綜述報道，但尚無在人參皂苷轉化應用中的系統研究。文中通過對人參皂苷單體生物轉化理論和應用研究最新進展的回顧，結合目前廣泛采用的生物催化方法的討論，系統梳理歸納了能夠改善產物專一性、提高催化效率，且具有工業應用前景的人參皂苷單體定向轉化方法。基于酶分子設計以及離子液體溶劑工程，對人參皂苷單體抗癌藥物和食品、保健品市場的開發、規模化制備進行了展望。

人參皂苷，生物催化，全細胞轉化，酶法轉化，離子液體

腫瘤是全球致死率最高的惡性疾病，危害人類的生命與健康[1]。目前臨床上腫瘤治療藥物很多來源于植物，如紫杉醇、雷公藤甲素等，而現代藥理學研究表明，來源于人參、西洋參和三七中的重要次級代謝產物人參皂苷具顯著抗癌效果，而尤以稀有人參皂苷及苷元的抗腫瘤、保護神經系統、保肝護肝等藥理活性最為顯著[2]。而人參皂苷、次級皂苷和皂苷元等成分在人參屬植物中含量較少，體內轉化量和生物利用度極低，須通過體外總皂苷降解獲得。

通過多種技術手段去除骨架結構達瑪烷四環三萜支鏈上所連糖基，定向獲得人參皂苷單體成為研究的熱點[3]。已經通過酸或熱處理方法轉化并分離出289種純人參皂苷單體[4]。由國家藥品監督管理局(SFDA) 批準上市的抗癌新藥參一膠囊(人參皂苷Rg3)，成為我國首個實現人參皂苷工業化生產的一類中藥單體抗癌藥物。國家SFDA唯一認可的人參皂苷Rh2產品今幸膠囊，純度98%的20(S)-Rh2經極其復雜的大孔樹脂吸附、硅膠柱層析分離提取工藝獲得，每斤價格高達100多萬人民幣[5]。

基于微生物及其酶的生物催化由于反應特異性高、條件溫和、副產物少、后處理簡單成為解決其瓶頸問題的最可行手段。原人參萜二醇(Protopanaxadiol，PPD) 型及原人參萜三醇(Protopanaxatriol，PPT) 型皂苷通過細胞轉化或發酵以不同的水解途徑轉化為去糖基化(Deglycosylation) 的人參皂苷[6]。實質為糖苷水解酶(Glycoside hydrolase，GH) 對其側鏈糖基(以1–4分子的D-葡萄糖、L-阿拉伯吡喃糖苷、L-阿拉伯呋喃糖苷、D-木糖和/或L-鼠李糖等組成) 的特異性水解[7]。金鳳燮課題組從微生物培養物、植物提取物得到人參皂苷糖苷酶(纖維素酶和糖苷酶新亞類)，并依據底物糖基連接位置和內、外側糖殘基水解特異性進行了分類[8]。Shin等[7]對不同來源人參皂苷GH歸屬、分子量、最適反應pH、溫度、比活等生化特性進行了總結。

微生物、酶法轉化相比化學法在持續性、選擇性和再生等方面的優勢如表1所示。相比化學法，微生物及其酶的生物轉化僅存在溶劑耐受性和轉化率方面的不足；相比微生物法，酶法主要存在成本和再生等問題[9]。本文綜合人參皂苷生物轉化最新進展的回顧，及目前廣泛采用的生物催化方法的討論，認為基于蛋白質工程的酶分子改造和綠色溶劑工程(以離子液體為主) 的催化體系構建，在高效、定向轉化人參皂苷單體方面有廣闊的工業應用前景。

表1 不同催化方法的特點和選擇

1 人參皂苷糖基代謝及對藥理活性的影響

通常人參根可直接口服，或以粉末或提取物通過能量飲料、茶和功能性補充劑食用。然而，口服人參對主要人參皂苷的吸收來說是無效的[20]。因為糖基化人參皂苷在腸道中的生物利用率非常低(比如Rb1為0.1%–4.4%; Rb2為3.7%)，且容易通過膽道或泌尿系統排出[11-12]，需要通過腸道微生物群對其藥物代謝動力學特性的改變來逆轉低生物利用度，最終被位于腸壁的天然微生物群降解為容易被吸收并生物活性稀有人參皂苷(Rg2、Rg3、Compound K等) 和苷元[13]。

稀有人參皂苷單體及其衍生物能夠調控癌細胞炎癥、氧化應激、血管生成、轉移信號路徑，單獨或者結合其他藥材治療癌癥[2]。基于糖基數量、位置和糖配基類型、雙鍵位置和立體選擇性，Quan等[14]通過酸轉化快速制備了23種稀有人參皂苷，并基于它們對6種癌細胞(包括HCT-116、HepG2、MCF-7、Hela、PANC-1和A549) 的細胞毒性作用分析了其皂苷結構-藥理活性關系。Wei等[15]研究脂肪酸酯化法修飾Rh2，在體內抗腫瘤活性不變的同時，二辛酰酯(D-Rh2)體外對人肝細胞系QSG-7701毒性相比親本Rh2顯著降低。D-Rh2可能通過刺激淋巴細胞對腫瘤細胞產生細胞毒性而間接影響腫瘤生長，較低副作用的D-Rh2可用作抗腫瘤候選藥物。

天然化合物人參皂苷的體外修飾與轉化增加了人參皂苷結構多樣性。為深入研發高抗癌活性藥物的應用，本課題組在前期的研究工作中通過酸轉化、柱分離制備了一系列稀有皂苷及其組合物，通過抗腫瘤活性分析及初步臨床觀察，發現PPD型人參皂苷雙鍵異構體Rk1和Rg5 (即Rg3 C-20處脫羥基產物) 因抗癌活性優異而極具開發潛力。皂苷單體殺傷腫瘤細胞作用的強度與苷元類型、糖鏈長短及C-20立體異構有關，改造單體結構可增強抗腫瘤活性[6,14,16]。

以酸水解、高溫等改變皂苷結構的化學法，均存在價格高、選擇性差、副產物多等問題，工業化生產不易實現，多數單體分子結構和抗腫瘤活性的構效關系仍不能被完全闡明[14]。通過微生物及其酶系的生物催化，由于反應特異性高、條件溫和、副產物少、后處理簡單，適于稀有人參皂苷Compound K、Rg3及其衍生物等轉化制備。生物轉化修飾結構已涉及羥基化、環氧化、甲基化、異構化、酯化、水解、醇和酮之間的氧化還原、脫氫等多種反應類型[17]。而人參皂苷結構修飾主要在于對特定位點的糖基進行水解，通過不同位置糖鏈結構的變化來改善化合物的生物活性。

2 菌體及酶法轉化人參皂苷單體

生物催化劑應用形式(即細胞懸浮液、無細胞提取物和純化酶) 一般取決于下游加工及菌體固有特性[18](圖1)。細胞為酶提供了天然環境并防止蛋白構象變化，多種胞內、胞外酶的產生取決于生長條件和細胞發育狀況。全細胞催化有利于節約人力、生產成本、維護成本。微生物多樣性是菌體對各類自然條件(例如溫度、pH、壓力和鹽) 長期適應的結果，極端微生物在實驗室條件下通常很難生長。除常規的富集培養，還可通過宏基因組(Metagenome) DNA庫篩選或序列搜索發現新的功能基因，再結合適當的克隆載體和宿主獲得工程菌[19]。酶較全細胞對一步反應更有優勢，負責生命過程所有必需代謝反應的催化，一般反應條件溫和，pH、溫度范圍有限，體外僅在最佳pH和溫度條件下發揮作用。純酶反應特異性更高，而酶的分離和純化過程耗時費錢。

圖1 由分離酶或全細胞進行生物催化的比較(改編自參考文獻[18])

2.1 菌體/全細胞催化

微生物能夠通過全細胞或發酵以不同代謝途徑對人參皂苷進行去糖基化(Deglycosylation)[6]。例如，以人參皂苷Rb1為底物轉化生產Compound K (已證明具諸如抗癌、抗炎、抗過敏、抗糖尿病、抗血管生成、抗衰老、神經保護和保肝作用等生物學功效[20])，枝孢霉菌[21]兼具兩條水解途徑：Rb1→G17→F2→Compound K→和Rb1→Rd→F2→Compound K；葉森金桿菌和人體腸道菌群[22]兼具3條水解途徑：Rb1→F2→Compound K、Rb1→G17→G75→Compound K或Rb1→G17→F2 → Compound K。

腸道菌群中的乳酸桿菌和雙歧桿菌屬spp.可合成對人參皂苷去糖基化所必需的多種糖苷酶(EC 3.2.1)，包括β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.2)、纖維素酶(EC 3.2.1.4)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、α-L-阿拉伯糖苷酶(無EC編號)和β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)[10,23]。腸道微生物組成及其糖苷酶活性對人參皂苷CK、Re等的代謝調控有重要作用[24]。而以人參皂苷為碳源進行的腸道細菌體外厭氧培養轉化，存在培養基昂貴、產率低的問題[10]。

人參栽培土壤中可以分離用于人參皂苷轉化的真菌[9]。曲霉屬含β-葡萄糖苷酶約250種，在食品和飲料領域應用了1 500年，其中黑曲霉和米曲霉列為美國FDA通常被認為是安全的(GRAS) 名單[25-26]。Lin等[27]直接使用雜色曲霉產孢子階段分泌于固體培養物中的胞外β-葡萄糖苷酶進行人參皂苷Rb1到Rd的轉化。孢子懸浮系統從搖瓶放大至2 L時的最大生物轉化率85% (/)。因培養基便宜且生長較快，該類土壤真菌的轉化較腸道細菌更經濟可行，被指定為GRAS的土壤微生物能應用于食品領域。

預計到2021年益生菌市場總量增長至580億美元[28]。以益生菌修飾人參皂苷糖基結構，有助于其保健品特性的強化和規范。Ku等[10,29]分別用長雙歧桿菌RD47和鼠李糖乳桿菌GG將人參皂苷Rb2、Rc和Rb1水解為人參皂苷Rd。作為牛奶、蔬菜等食物發酵劑的乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB) 在稀有人參皂苷的轉化應用方面，Park等[30]首次通過食品級明串珠菌和乳酸桿菌全細胞轉化生產Compound K。Huq等[31]以LAB在經濟可食用培養基(有20 g/L蘿卜，20 g/L葡萄糖和10 g/L酵母提取物) 上經7 d發酵后，人參皂苷Rb1可轉化Rg3，而MRS培養基中只能轉化到Rd。作為表達外源基因高效生產酶蛋白的GRAS宿主，Li等[32]通過強化密碼子，在乳酸乳球菌中表達克隆自膠質類芽孢桿菌的重組β-葡萄糖苷酶，轉化人參皂苷Rb1和Rd為F2。

在三萜合成途徑構建方面，以釀酒酵母為代表的微生物工程已被廣泛用于人參皂苷的轉化[33-34](表2)。經鑒定Cyt P450酶(CYP716A47) 參與達瑪烷型人參皂苷前體達瑪烯二醇-II C-12位羥基化，Han等[35]通過在中 CYP716A47和達瑪烯二醇合酶基因(PgDDS) 的共表達，不添加達瑪烯二醇-II即可產生PPD。Dai等[36]在中引入達瑪烯二醇-II合成酶、PPD合成酶基因以及擬南芥NADPH-細胞色素P450還原酶(ATR1) 基因，并通過過量表達截短(Truncation) 的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶、法呢基二磷酸合成酶、角鯊烯合成酶和2,3-氧化角鯊烯合成酶基因，以及提高PPD合酶活性的密碼子優化，最后通過雙相萃取發酵獲得8.40 mg/g DCW PPD (1 189 mg/L)。Zhao等[37]通過引入人參達瑪烯二醇-II合成酶、人參細胞色素P450型PPD合成酶(PPDS) 和擬南芥ATR1基因，在中構建了PPD的生物合成途徑，經細胞色素P450氧化系統優化，在5 L生物反應器中補料分批發酵，PPD產量達到1 436.6 mg/L。

表2 微生物基因工程菌全細胞催化轉化人參皂苷

“→” represents one-step reaction; “→→” represents more than one-step reactions; “/” representsdata not mentioned.

通過在微生物底盤細胞中重構與優化天然化合物的生物合成途徑, 實現目標化合物的從頭合成。被首次表征的用于植物四環三萜底物糖基化的UDP-糖基轉移酶(UGT) UGTPg1，轉移葡糖基部分到PPD的C-20S-OH得到Compound K，是經一鍋反應由簡單糖生物合成Compound K成功的關鍵[38]。Wang等[39]從人參中克隆并鑒定了兩種基因：45和29，結合產PPD的酵母底盤細胞，成功構建了由葡萄糖生產Rh2和Rg3的酵母細胞工廠。Wei等[40]證明從人參分離的新型基因100和101可特異糖基化PPT的C6-OH分別產生人參皂苷Rh1、F1，在酵母底盤細胞中構建了F1和Rh1的合成途徑。Zhuang等[41]將用于PPD到人參皂苷Rh2轉化的微生物糖基轉移酶UGT51通過半理性設計，將突變糖基轉移酶基因引入酵母并經代謝工程進一步優化后，在5 L生物反應器中補料分批發酵，Rh2產量達到約300 mg/L。

畢赤酵母與遺傳操作相似且外源蛋白表達量更高，Zhao等[42]通過在中自組裝達瑪烯二醇-Ⅱ合酶和角鯊烯環氧酶促使達瑪烯二醇-Ⅱ產量增加2.1倍。Li等[43]通過在大腸桿菌中重建2,3-氧化角鯊烯衍生的三萜類化合物生物合成途徑，成功構建產達瑪烯二醇-Ⅱ的底盤，達瑪烯二醇-Ⅱ異源生物合成，發酵48 h產率為8.63 mg/L。但是這些工作目前還僅限于達瑪烷型人參皂苷前體達瑪烯二醇-Ⅱ的合成, 尚未真正意義上實現合成人參皂苷。

通過外源生物合成途徑重建的工程菌直接從人參皂苷為底物合成稀有人參皂苷。Yu等[44]通過尿苷二磷酸糖基轉移酶(UTG) 基因工程化大腸桿菌分別由20(R)-PPD和20(R)-PPT轉化生產20(R)-Compound K和20(R)-F1。Lu等[45]鑒定了參與人參皂苷Rg1和Rb1生物合成的UDP-糖基轉移酶，并實現了中的全細胞催化。

2.2 酶催化

微生物的代謝易受環境影響，轉化人參皂苷的選擇性差、產率低，參與反應的酶未確定。酶促轉化由于操作方法簡單且反應特異性強，被認為是結構修飾和代謝研究的有用工具。優化微生物產酶條件，實現生物量和產酶之間的平衡，尤以最大限度縮短處理時間、降低成本的重組酶轉化最為顯著[46]。

在中過表達各種重組β-葡糖苷酶以酶解糖基化的人參皂苷。Cui等[47]用重組酶在10 L發酵罐轉化20 mg/mL Re得到113 g色譜純(84.0±1.1)%的Rg2 (S)，首次實現100 g級Rg2 (S)酶法生產。Kim等[48]補料分批培養強化表達β-D-糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的.，通過立體專一酶的級聯轉化，由人參葉提取物獲得人參皂苷Compound K。Shin等[49]將能完全轉化 所有PPD型皂苷為Compound K的β-糖苷酶在重組表達，可將丟棄人參葉的PPD型皂苷轉化為Compound K。Xie等[50]過表達來自嗜熱酶α-丙氨酸呋喃糖苷酶，85 ℃、pH 5.0、1 h內轉化25 g/L Rc為21.8 g/LRd，Rd產率為21 800 mg/(L·h)。Quan等[51]首次報道了高熱穩定性重組β-葡萄糖苷酶分別將人參皂苷Re和Rg1轉化為人參皂苷Rg2和Rh1，在酶濃度1.36 U/mL、85 ℃、pH 5.5、1 h內轉化10 g/L人參皂苷Re為8.02 g/L Rg2， 2 g/L人參皂苷Rg1為1.56 g/L Rh1。

重組酶轉化人參皂苷可能應用于醫藥或制藥行業。然而在食品(尤其營養保健品) 行業中，常被認為是不可食用細菌[52]。為提高用于人參皂苷微生物轉化的糖苷酶產量，有必要在以下方面進一步改善：1) 開發廣泛的食品級宿主；2) 提高細胞生物量和酶產量；3) 確定用于酶誘導的最佳培養基組分[53]。

益生菌適合食品級糖基化酶的生產，其 MRS培養基價格也僅為的3倍。以含外源基因重組質粒的益生菌系統替代，Youn等[54]在雙歧桿菌中表達克隆自動物雙歧桿菌的重組β-葡萄糖苷酶以轉化人參皂苷Rb1和Rb2。由于轉基因應用于食品工業引發的爭議，又轉向以經典發酵法生產糖苷水解酶，篩選新的益生菌菌株并優化細胞培養條件。來源于蘑菇真菌的菌絲體酶制劑(菌體培養2周，25 ℃，經酶提取、硫酸銨沉淀、透析、凍干) 轉化Rb1到Compound K，最適培養條件為72–96 h、pH 4.0–4.5、溫度45–55 ℃[55]。對于20 mg 花費達163.2美元的98% F1，除了僅停留在確定微生物酶轉化能力的小規模實驗，Wang等[56]首次報道了以GRAS微生物食品級的商業酶Cellulase KN在48 h內完成對Re和Rg1 (源自10 mg/mL PPTGM) 至F1的10 g級轉化。

除了水解人參皂苷的糖基，微生物也能轉化產生高生物活性的人參皂苷化學衍生物。Zhou等[57]以擬青霉sp. 229對人參皂苷Rb1的6 L發酵中，通過反復硅膠柱層析和高壓液相色譜分離純化出3-酮衍生物和兩種新的脫氫代謝物。不同類別的酶能選擇性修飾天然化合物的復雜反應性官能團而產生一系列衍生物，Teng等[58]以乙酸乙烯酯作為乙酰基供體，在有機溶劑中通過來自南極假絲酵母(Novozym 435) 脂肪酶區域選擇性地酰化人參皂苷，得到單酰基人參皂苷。Gebhardt等[59]通過來自牛初乳的β-1,4-半乳糖基轉移酶和Novozym 435脂肪酶的催化，制備獲得了人參皂苷Rb1的一系列特異性衍生物。

2.3 糖苷酶固定化

相對于游離酶，固定化酶為適于工業化應用的主要形式。基于吸附、包埋、交聯、共價結合的酶的固定化方法的選擇，以考察固定化酶操作穩定性為主，綜合考慮工業放大時的技術可行性和固定化過程中涉及的酶、載體及試劑的費用。而提高時空產率高效酶反應器的開發，進一步推動了固定化酶技術在生物轉化領域中的研究應用。而應用于人參皂苷轉化的酶固定化報道僅有3篇。Zhang等[60]以交聯-包埋法(交聯3 h，戊二醛濃度0.1%，海藻酸鈉濃度1%，CaCl2濃度2%)固定化酶轉化人參皂苷Rg1為F1，3.76 U/g固定化酶載體，0.2 mg/mL底物，40 ℃轉化2 d，4次平均轉化率為80.49%。Yu等[61]以SiO2吸附蝸牛酶然后結合交聯-包埋法(海藻酸鈉質量濃度2%，CaCl2質量濃度2%，SiO2與蝸牛酶質量比為1∶1) 制備微球固定化蝸牛酶，轉化人參皂苷Rb1為Compound K，55 ℃，1.0 mg/mL底物，轉化36 h，5次平均轉化率為 36.79%。為解決酶與載體吸附力弱、與底物接觸面積有限的問題，Yuan等[62]將纖維素酶固定在用聚乙烯亞胺和戊二醛活化的角叉菜膠珠表面，轉化人參皂苷Rb1為 Rd，同時測定了反應動力學參數m和max，在連續使用5次后，固定化酶可以保持初始活性的60%。

Graebin等[63]特別關注了糖苷酶家族GH1和GH3中β-葡萄糖苷酶的固定化方法。物理吸附、離子交換、疏水作用等增強了固定化體系酶的靈活性，相應載體包括土壤膠體顆粒、離子交換樹脂、磁性Fe3O4納米顆粒等。尤其絲瓜蔬菜海綿[64]、含氧化鐵的細小土壤膠粒[65]等天然可降解、成本低廉載體的使用大大減少了化學載體丟棄時涉及的成本和環境問題。包埋固定化可改善酶的熱穩定性、最佳使用溫度和儲存穩定性，但機械強度較低且酶滲漏導致固定化成本增加[66]。關于其相對活性和包封率，因納米級聚合物材料(聚氨酯、乳膠和硅膠) 代替傳統藻酸鹽珠的應用得到改善[67]。共價固定化可提高酶制劑穩定性，載體包括最常用殼聚糖及其他海綿、咖啡渣、硅膠、SiO2納米顆粒、環氧樹脂活化Eupergit C、胺瓊脂糖凝膠等。

吸附或包埋固定β-葡糖苷酶由于酶逐漸釋放導致催化劑半衰期有限；經化學反應的共價固定化引起酶活損失[68]。為克服這些問題，Mateo等[69]研究了酶物理聚集再交聯(交聯酶聚集體，CLEAs) 制備固體生物催化劑的方法。通過形成納米尺度CLEAs將β-葡糖苷酶固定于二氧化硅泡沫。高酶載量CLEAs在更廣泛的溫度和pH范圍保持活性，且比游離酶m低，可使用多達10個循環，殘余活性超過85%[68]。近來GH1家族β-葡糖苷酶結構的解析有助于定點固定化工作的展開。經定點誘變后，酶與載體進行固定化，穩定性提高的同時獲得產物抑制降低，活性、專一性提高等優勢特性[63]。而基于重組DNA的新酶設計經過微生物的遺傳修飾，驗證食品安全性的同時，也應充分考慮酶及其載體釋放到加工系統可能帶來的安全隱患[70]。

3 糖苷酶轉化分子機制的探究

為解決微生物發酵及自身酶系對人參皂苷糖苷鍵催化存在的專一性差、效率低等問題，基于酶高級結構、分子識別機制改造酶結構，并通過基因工程菌表達以高效轉化目的人參皂苷單體。Mak等[71]綜合基因組挖掘(Integrative genomic mining approach) 結合生物信息和分子建模采掘序列數據庫(Mine sequence databases)，使酶對目標反應專一性提高100倍，催化效率提高了75倍。因此除了針對特定產物挖掘專一性的新酶，研究工作還應集中在基于催化分子機制的酶分子改造。

糖苷酶家族活性結構域拓撲學構象有3種：口袋式(Pocket)、裂隙(Cleft 或Groove)、隧道(Tunnel)[72]。基于構效關系水解酶定向轉化與分子識別的報道較多[73-75]。基于高分辨高葡萄糖耐受β-葡糖苷酶(Bgl6) 和三重突變體M3(隨機誘變提高熱穩定性)的晶體結構，Pang等[75]發現Bgl6形成的額外通道可作為葡萄糖二級結合位點，有助于葡萄糖耐量；三重突變增強酶內的疏水相互作用，可能是M3熱穩定性增強的原因。Zhang等[76]基于活性位點比對和量子化學計算得出化學必需的相互作用，以驗證催化機理假說揭示糖苷水解酶結構與功能的關系。

關于糖苷酶轉化皂苷的催化機制的研究，如圖2所示，人糞便GH3β-葡萄糖苷酶基因BIBG3經克隆、結構分析，發現BIBG3絡合D-葡萄糖的獨特環狀結構可參與底物結合口袋的形成，通過和底物的分子對接揭示了口袋的結合方式，找到關鍵酶活突變位點R484和H642[77]。而酶分子設計改造的報道迄今僅有3篇。Park等[78]分離出具廣泛底物譜β-GH并測定其晶體結構，基于產物特性、底物對接，以在三萜類化合物特定糖基化位點優先水解聚糖的方式，重新設計了酶底物結合裂隙。使對Rb1的催化效率提高4–7倍，促進PPD型底物Rb1、Rb2和Rb3 (Rc) 經過F2到C-K的繼續轉化 (圖3)。Choi等[79]通過同源建模、分子對接、序列比對，確定參與α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的候選殘基；經定點突變得到的L213Aβ-糖苷酶變體具有野生型沒有的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性，促進Rc進一步水解轉化為Rd，轉化率比野生型酶高1.5倍 (圖4)。在酵母底盤細胞重構與人參皂苷的生物合成途徑優化方面，Zhuang等[41]通過同源建模、分子動力學和突變研究了UGT的催化分子機制[40-41,45]。且經半理性設計的UGT51對PPD到Rh2的催化效率提高了約1 800倍。

圖2 BlBG整體結構及其催化Rb1反應活性位點幾何結構分析(改編自參考文獻[77])

蛋白質工程是提高酶對特定人參皂苷糖苷水解活性的有用工具。多種不同來源具人參皂苷轉化活性的微生物糖苷酶(尤其β-葡萄糖苷酶) 晶體結構已經被解析[7]，因此可通過同源建模、分子對接設計、突變以改造酶分子，改善底物特異性和催化效率，產生高純度的各種特殊三萜類化合物，實現目的人參皂苷專一、高效的酶法轉化。

4 離子液體對生物催化性能的改善

不同于分子組成的傳統液體溶劑，大多常溫下呈液態鹽(由特定的有機陽離子與無機或有機陰離子構成) 的離子液體(Ionic liquids，ILs)，具飽和蒸氣壓低、不可燃、親疏水、可設計等特性。研究最為廣泛的是 ILs 及其水溶液中脂肪酶、蛋白酶和酯酶的催化，而對于糖苷酶水解作用的研究很少[80]。通常，疏水、低粘度、表面活性、親電陰離子和離液陽離子(Chaotropic cation) 的ILs增強酶活性和穩定性[80]。然而由于許多結果矛盾沒有一般相關性規律，因此，以提高酶活性和穩定性的方法正在探索，如水中ILs微乳液、設計與酶相容的離子溶劑、酶電荷的修飾、酶的固定化等[81]。

圖3 BGL167整體結構及其催化PPD型人參皂苷反應活性位點幾何結構分析(改編自參考文獻[78])

圖4 來自S. solfataricus的β-糖苷酶配體對接和序列比對及其突變體催化人參皂苷Rc生物轉化途徑(改編自參考文獻[79])

4.1 離子液體參與水相轉化應用概況

全細胞催化存在催化劑不穩定、產物抑制、有毒副產物形成和質量傳遞等問題。在水-ILs的兩相催化中，由于全細胞懸浮在水相而有機底物溶解在疏水ILs相(或貯存產物)，從而避免了反應中低水溶性的底物(或產物) 抑制。Chen等[82]在含ILs體系中全細胞催化水解甘草甜素制備單葡萄糖醛酸甘草次酸，發現在咪唑類ILs存在下，ILs提高了細胞膜通透性，且相比BL21和GS115，青霉Li-3對ILs (主要為[Bmim] [PF6]) 耐受性最強，60 h收率達87.63%。ILs在生物催化中的應用需綜合對所需化學反應(產物分離) 的溶劑性質和對全細胞的溶劑毒性作用。而ILs對微生物細胞的 毒性是其工業應用瓶頸之一，目前在含ILs系 統中研究最多的微生物是和釀酒酵母。Egorova等[18]研究了ILs毒理學特性，從反應介質(溶劑) 角度分析了全細胞在苛刻化學催化中的應用前景。

酶能夠在體外不適合細胞生長的條件下進行催化，專一性強、催化方式簡單。離子液體中陽離子或陰離子類型對酶的活性、穩定性和結構具重要影響。Yanhong等[83]對含C6MIm·BF4體系黑李種子β-糖苷酶糖基化紅景天苷合成條件進行優化，發現陽離子咪唑環上的烷基取代基的最佳鏈長為C6。Ferdjani等[84]研究了在ILs/水不同比例時嗜熱棲熱菌β-糖苷酶和兩種分別來自海棲熱袍菌嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-半乳糖苷酶的活性、穩定性，發現在適合水溶性ILs (Water-miscible ILs) 中β-糖苷酶熱穩定性最高。Brakowski等[85]發現含ILs-水緩沖乳液中，[Bmim][Pf6]導致來自奧氏曲霉的β-半乳糖苷酶轉糖基底物專一性的改變。Kudou等[86]基于咪唑ILs磷酸鹽緩沖液，在乙酸1-丁基-3-甲基咪唑鎓[Bmim] [OAc]，pH 7.0，葡糖苷酶水解活性最高，通過穩態發射光譜證明糖苷酶活性改善可能與酶構象的靈活性有關。

由于毒性低、生物可降解、易于制備、具100%原子經濟等特點，基于含膽堿鹽和三類氫鍵供體(酰胺、醇和糖) 的低共熔溶劑(DESs)可作為傳統離子液體的廉價替代品，成為β-葡萄糖苷酶催化的新型綠色溶劑，可拓展其在食品和醫藥領域方面的應用。以對硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷作為水解反應模型，Xu等[87]發現基于氯化膽堿的DESs (含6% (/) 水的氯化膽堿/丙二醇) 顯著改善β-葡萄糖苷酶的活性和穩定性。在ILs中可通過酶表面電荷修飾和酶固定化來進行酶的穩定和激活，以增強在ILs中的耐受性。Zhao等[88]總結了固定化酶在ILs中被穩定和激活的實例，但大多數與脂肪酶有關。最新報道了Jason等[89]以陽離子化的葡萄糖苷酶降解溶于ILs的纖維素，極大提高了纖維素降解效率(100 ℃以上的催化效率是在水溶液時的30倍) (圖5)。表面陽離子化修飾的葡萄糖苷酶(以ILs代替水作溶劑，通過碳二酰亞胺介導N,N′-二(2-氨乙基)-1,3-丙二胺定向偶聯酶表面天冬氨酸和谷氨酸殘基)在ILs中溶解度增加，在苛刻實驗條件下依然能以恒定速率工作至少7 d。

ILs中酶以與偶聯載體(聚合物、納米微粒或碳納米管)、被水凝膠包裹或以原始狀態懸浮的方式進行固定化。無固相支撐的CLEAs有望提高ILs中酶穩定性，Toral等[90]發現CLEA和在聚丙烯上吸附交聯的固定化脂肪酶能夠在使游離酶失活的ILs (如[BMIM][NO3]) 中仍然保持催化活性。溶膠-凝膠基質具有防止反應過程中酶從載體泄漏的優點，而凝結和干燥過程中的凝膠收縮可能導致酶變性。通過在溶膠-凝膠固定化過程中添加離子液體，可提高包封酶的固定效率以及機械抗裂性，表明離子液體在酶性能中起著重要作用[91]。

圖5 離子液體體系纖維素酶非水均相轉化多糖催化機理(改編自參考文獻[89])

4.2 在酶轉化人參皂苷中的應用潛能

在人參皂苷生物轉化方面尚無ILs的應用，首先就人參皂苷溶解性進行分析。大多數人參皂苷在含水正丁醇(常作為皂苷萃取溶劑) 中溶解度較大，而次級苷由于糖數目減少、極性減小、在水中溶解度降低，苷元則難溶于水。例如，Re不易溶解于水，而在DMSO中溶解度達200 mg/mL。Cui等[40]以20 mg/mL人參皂苷Re在含10% DMSO緩沖液中進行轉化，實現了10 L發酵罐中100 g級Rg2(S)的酶法生產。來源于蘑菇真菌菌絲體的酶轉化制備Compound K時，在底物Rb1中加入甲醇助溶[55]。

據此，有望以非揮發、環保的ILs代替DMSO和甲醇有機溶劑發揮對底物的助溶作用。以咪唑類ILs提取和富集三七中藥材及其制劑中的微量人參皂苷20(S)-Rg3和Rk1[92-94]，進一步證明ILs有助于增加稀有人參皂苷溶解度，可開發應用于人參皂苷的生物催化轉化。結合以上ILs參與其他類型產物的水相反應的生物轉化時對全細胞及酶催化性能的影響，可能獲得比在有機溶劑時更高的催化活性、選擇性和穩定性。因而，ILs參與的稀有人參皂苷生物催化體系的構建，在轉化工藝中除ILs對底物溶解性作用外，還需要考慮作為反應介質ILs對菌體毒性或酶催化性能的影響，以及作為酶修飾劑，ILs的改性方法及酶穩定化的應用形式。

5 展望

稀有人參皂苷生物催化轉化的關鍵問題包括特異性酶活性不高、涉及酶及其催化機制不明確、結構生物信息學研究不系統，改變酶水解皂苷糖基專一性的研究尚處于起步階段。益生菌及其酶的使用已在食品工業中的實用應用中顯示出巨大潛力。而離子液體可以通過改變反應體系的極性增加糖類的溶解度，為合理設計糖基轉化反應體系創造多種機會。因此，今后研究工作應集中在：1) 基于同源建模、分子對接催化分子機制的揭示來改造酶分子，以改變酶專一性、提高酶活性和穩定性；2) 基于ILs的溶劑工程在酶固定化及酶表面修飾的作用，改善酶轉化人參皂苷的催化效率和穩定性。通過篩選及構建基因工程菌、發酵或胞外表達GH，以化學修飾并制備多種不同尺度、形態的益生菌酶制劑。同時，以光譜法、計算機模擬等可視化技術研究ILs-酶-底物相互作用，系統分析ILs反應體系中影響糖苷酶結構及其活性、專一性和穩定性的催化分子機制。最終實現對人參皂苷定向、高效的生物轉化工藝，有助于深入探究并開發新癌癥化學預防的藥物化學和藥理學方法。

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Biocatalytic strategies in producing ginsenoside by glycosidase-a review

Weina Li1,2, Yunyun Jiang1,2, Yannan Liu1,2, Chunying Li1,2,and Daidi Fan1,2

1 Shaanxi Key Laboratory of Degradable Biomedical Materials, School of Chemical Engineering, Northwest University, Xi’an 710069, Shaanxi, China 2 Shaanxi R&D Center of Biomaterials and Fermentation Engineering, College of Chemical Engineering, Northwest University, Xi’an 710069, Shaanxi, China

is a traditional Chinese medicine with significant pharmaceutical effects and wide application. Through orientational modification and transformation of ginsenoside glycosyl, rare ginsenosides with high antitumor activities can be generated. Traditional chemical methods cannot be applied in clinic. because of extremely complex preparation technologies and very high cost Transformations using microorganisms and their enzymatic systems provide the most feasible methods for solving the main problems. At present, the key problems in enzymatic synthesis of ginsenosides include low specific enzyme activities, identity of enzymes involved in the enzymatic synthesis, and their catalytic mechanisms, as well as nonsystematic studies on structural bioinformatics; specificity of enzymatic hydrolysis for saponin glycosyl has been rarely studied. Many reviews have been reported on glycosidase molecular recognition, immobilization, and biotransformation in ionic liquids (ILs), whereas ginsenoside transformation and application have not been systematically studied. To evaluate theoretical and applied studies on ginsenoside-oriented biotransformation, by reviewing the latest developments in related fields and evaluating the widely applied biocatalytic strategy, this review aims to evaluate the ginsenoside-oriented transformation method with improved product specificity, increased biocatalytic efficiency, and industrial application prospect based on the designed transformations of enzyme and solvent engineering of ILs. Therefore, useful theoretical and experimental evidence can be obtained for the development of ginsenoside anticancer drugs, large-scale preparation, and clinical applications in cancer therapy.

ginsenosides, biocatalysis, whole cell conversion, enzyme conversion, ionic liquids

January 31, 2019;

April 2, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 21576160), National Natural Science Foundation of China Young Scientists Fund (No. 21706211), Postdoctoral Science Foundation of China (No. 2015M582698).

Daidi Fan. Tel/Fax: +86-29-88303360; E-mail: fandaidi66@126.com

國家自然科學基金 (No. 21576160)，國家自然科學基金青年科學基金 (No. 21706211)，博士后科學基金 (No. 2015M582698) 資助。

2019-04-11

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190411.0856.002.html

李偉娜, 蔣云云, 劉彥楠, 等. 人參皂苷單體定向轉化的生物催化及應用進展. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1590–1606.

Li WN, Jiang YY, Liu YN, et al. Biocatalytic strategies in producing ginsenoside by glycosidase -a review. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1590–1606.

(本文責編 郝麗芳)