不同炮制方法對中藥黃芪中糖類和氨基酸類成分含量的影響

江國榮 禤雪梅 劉肖林 蒙鳳貞 廣東省佛山市第一人民醫(yī)院(中山大學(xué)附屬佛山醫(yī)院)藥劑科 528000

《中國藥典》收載的是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.var.mogholicus(Bge)Hsiao或者膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.的干燥根[1]。中藥黃芪性微溫，味甘，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、斂瘡生肌的作用，是臨床上的常用藥材，其中黃酮類、糖類、皂苷類以及氨基酸類是藥材中的有效成分，可以發(fā)揮多種藥效。中藥黃芪的炮制在宋代就已經(jīng)出現(xiàn)，到了明代炮制方法多樣化[2]，炮制的目的在于提高藥材的藥效、降低毒性以對臨床用藥的安全有效性提供保障，炮制方法的不同對效成分含量的影響差異性大[3-4]。本文通過酒制、炒制、鹽制三種炮制方式，分析與生品比較中藥黃芪中糖類和氨基酸成分的變化情況。

1 儀器與試藥

1.1 試驗儀器 美國Wasters公司生產(chǎn)的PiCo-Tag氨基酸分析系統(tǒng)(含有PiCo-Tag氨基酸分析柱)，美國梅特勒公司生產(chǎn)的電子分析天平(精密度0.001g)，紫外分光光度儀器(上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司，型號：721-110)。

1.2 試驗藥材 中藥黃芪為本市中藥材公司購買并經(jīng)專業(yè)人員鑒定為黃芪真品，甲醇、乙腈均為色譜純，水為三蒸水，醋酸、醋酸鈉、濃硫酸為分析純，葡萄糖對照品(生產(chǎn)批號為20141212)，5%苯酚試劑(生產(chǎn)批號：201410710)。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制方法

2.1.1 酒黃芪：稱取中藥黃芪300g加入60ml的米酒進(jìn)行攪拌，使得米酒與藥材浸潤充分后，靜置60min后炒干，備用。

2.1.2 炒黃芪：取同一批次的黃芪藥材300g，精密稱定后文火直接將黃芪藥材進(jìn)行翻炒，至顏色為棕黃色后停止，取出晾干后備用[5-6]。

2.1.3 鹽黃芪：稱取同一批次黃芪藥材300g，加入6g鹽水進(jìn)行攪拌，直至鹽水充分進(jìn)入藥材，文火進(jìn)行微炒，值顏色變?yōu)樽攸S色后取出，晾干，備用。

2.1.4 生黃芪：取同一批次黃芪藥材300g凈制后，用溫水(30～40℃)浸泡6min后取出，溫麻布覆蓋在藥材上潤透軟化2h后，切制成橢圓形片，置于60℃恒溫干燥箱中干燥，取出晾干后備用。

2.2 樣品溶液制備方法

2.2.1 糖類成分的提取：(1)水溶性糖類提取:稱取100g生黃芪和100g黃芪炮制品制成粗粉置于具有塞子的三角瓶中，加入30ml的85%乙醇溶液混合后55℃恒溫水浴鍋上加熱60min，過濾后濾液加熱。吸取2.0ml溶液于25ml容量中，加水至刻度，搖勻后備用。(2)多糖提取:采用水回流提取方法，將中藥黃芪不同炮制品制成粗粉，精密稱定，10倍量的水第1次回流60min，離心過濾藥液，回收藥渣再次采用8倍水回流45min，將2次濾液合并后濃縮，醇沉后除去雜質(zhì)。

2.2.2 氨基酸成分的提取：將各炮制品樣品粉碎，過60目篩，干燥至恒重，稱取10mg后精密稱定，分別放置于安瓿底部，加入6.0mol/L鹽酸溶液1ml，后進(jìn)行充氮反應(yīng)，在噴燈火焰上進(jìn)行封口，置于110℃烘箱中進(jìn)行水解，24h后取出放冷至室溫，將溶液取出后水洗進(jìn)行定容至10ml容量瓶中，搖勻靜置后濾過，備用。

2.3 氨基酸含量測定

2.3.1 氨基酸色譜條件：采用PiCo-Tag氨基酸分析柱，流動相醋酸—醋酸鈉緩沖溶液(pH 6.4)∶乙腈=60∶40，檢測波長為254nm，柱溫38℃，進(jìn)樣量為5.0μl。

2.3.2 線性關(guān)系：取2.2.2項下溶液稀釋成6.25、12.5、25.0、50.0nmol/ml，按照2.3.1項下色譜條件，柱前衍生法5.0μl進(jìn)樣檢測，以橫坐標(biāo)氨基酸峰面積，縱坐標(biāo)氨基酸濃度來進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明氨基酸在一定的檢測濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值有好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗：混合溶液按照2.3.1項下的色譜條件，柱前衍生法進(jìn)樣5次，記錄各種氨基酸峰面積和保留時間，其RSD值分別在0.25%～1.35%和0.45%～2.12%，表明精密度較好。

2.3.4 重復(fù)性試驗：吸取制備的氨基酸溶液平行制備5份樣品溶液，按照2.3.1項下的色譜條件，柱前衍生法進(jìn)樣5.0μl。記錄各種氨基酸峰面積和保留時間，其RSD值分別為0.14%～2.00%和0.40%～2.23%，表明重復(fù)性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗：吸取各個炮制品溶液在1、2、4、6、8h按照2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣，記錄各種氨基酸的峰面積，計算峰面積的RSD值在0.41%～2.13%，表明炮制品溶液中氨基酸在8h內(nèi)含量較為穩(wěn)定。

2.3.6 樣品含量測定：對2.2.2項下的溶液按照2.3.1的色譜條件進(jìn)行測定，以柱前衍生法進(jìn)行測定，不同炮制品中氨基酸的含量結(jié)果見表1。

表1 黃芪不同炮制品中氨基酸含量(%)

注：*表示必需氨基酸，“-”表示未檢測出。

2.4 糖類成分含量測定

2.4.1 糖類成分測定條件[7]： 硫酸—苯酚法測定糖類成分的含量，檢測波長為492nm。分別吸取上述2.2.1項下的水溶性糖和多糖0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0ml，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%苯酚溶液1.0ml后，加入5.0ml的濃硫酸溶液，振搖5min后置于沸水浴中加熱20min，取出置于冷水浴中進(jìn)行冷卻，紫外分光光度儀器中在490nm處進(jìn)行吸光度值的測定，以三蒸水作為空白項。以含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，水溶性糖回歸方程：A=48.010C-0.421(r=0.999 7)，多糖回歸方程：A=35.497C-1.124(r=0.999 8)。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗：樣品溶液在顯色后分別于0.5、1.0、2.0、3.0h放置后測定起吸收值，結(jié)果顯示在2.0h后樣品溶液的吸光度值無明顯的變化。

2.4.3 精密度試驗：精密吸取2.2.1項下的溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進(jìn)行操作，連續(xù)重復(fù)5次測定，測得的水溶性糖和多糖的RSD值分別為1.23%、1.38%，表明測定方法的精密度較高。

2.4.4 回收率試驗：取已測定含量的樣品溶液5份，每份各精密加入對照溶液，按照樣品溶液的制備項下進(jìn)行處理并進(jìn)行含量測定，測得的平均回收率水溶性糖為99.89%，多糖為100.23%，RSD值分別為1.24%、1.12%。

2.4.5 樣品含量測定：將已經(jīng)制備的樣品溶液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的測定方法進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定水溶性糖和多糖的含量，結(jié)果見表2。

表2 黃芪不同炮制品中糖類成分的含量測定(mg/g)

3 討論

中藥黃芪為臨床上重要的補(bǔ)氣藥材，主要用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛以及慢性腎炎蛋白尿、血虛萎黃等證[8]。祖國傳統(tǒng)的炮制理論認(rèn)為，生黃芪主要偏于對固表止汗有效果，炒黃芪則多用于益氣健脾、氣虛乏力、食少便溏之證。中藥材的化學(xué)成分比較復(fù)雜，中藥材在使用過程中也應(yīng)根據(jù)患者不同的疾病病情，采取針對性的治療措施，不同的炮制方法在同一種藥材中所制成的炮制品，其效用同樣也會存在一定的差異性[9]。在本次實驗研究中，對于不同的炮制品黃芪，糖類成分以及氨基酸成分的含量不同，這可能是不同的炮制品藥效發(fā)揮不同的治療效果的主要原因[10]。中藥黃芪經(jīng)不同炮制后總氨基酸的含量生黃芪的含量最高，其次為炒黃芪、酒黃芪，鹽黃芪中的總氨基酸的含量最低。各個不同的炮制品均含有的氨基酸數(shù)量超過14種，其中7種人體必需氨基酸各個炮制品中均有。必需氨基酸中生黃芪制品含量最高，炒黃芪中含量最低。各個炮制品中所含有的氨基酸則主要是以天冬氨酸、谷氨酸以及脯氨酸為主。本實驗結(jié)果也同時顯示，不同炮制方法對黃芪糖類成分影響較大，水溶性糖的含量在生黃芪中最高，炒黃芪中含量最低，多糖成分在酒黃芪中最高，生黃芪中含量則最低。

總之，中藥黃芪中有效成分變化直接造成了黃芪不同的臨床功效，炮制可以顯著改變中藥黃芪的化學(xué)成分含量，影響中藥黃芪的藥效。因此，應(yīng)該根據(jù)臨床上治療的需要，科學(xué)地選擇不同的黃芪炮制方法以達(dá)到有效的治療目的。