流式細胞術在血小板功能檢測診斷中的應用

黃 愷

解放軍第425醫(yī)院檢驗科，海南省三亞市 572000

血小板是應對血管損傷和防止過度失血的主要因素。這些小的血液成分能夠迅速附著在損傷部位，形成止血塞，以限制異常的失血。血小板在止血中的功能大致分為四個不同的過程，即血小板黏附、活化、分泌和聚集。血小板功能障礙(Platelet function disorder，PFD)的特征是容易或自發(fā)性瘀傷、黏膜出血或出血時間延長，并且具有異質(zhì)性表型[1]。它們可以是遺傳的，也可以是后天的，并且可能與低血小板數(shù)量(如血小板減少癥)有關[2]。PFD按照性質(zhì)的不同可以分為：血小板無力癥(GT)、儲貯池疾病(SPD)和巨大血小板綜合征(BSS)[3]。

準確的診斷對于生命質(zhì)量的提高和預防性治療危及生命的出血發(fā)生是至關重要的。PFD的實驗室診斷包含許多不同的技術。目前的診斷工具可以鑒定嚴重的PFD，尤其是GT；然而，對SPD和BSS等在內(nèi)的輕度PFD的鑒定能力相對較弱。而流式細胞術可以評估血小板計數(shù)低的樣本中血小板功能，因此已被建議作為目前診斷工具的可行替代方案。但是，流式細胞術需要對輕度PFD進行驗證并進行標準化，才能作為常規(guī)診斷手段。在本綜述中，我們將討論PFD的當前診斷策略、流式細胞術在血小板診斷中的潛在作用以及引入PFD新診斷檢測面臨的挑戰(zhàn)。

1 疑似血小板功能障礙的診斷檢查

在血小板功能檢測中，診斷PFD最常用的方法是光傳輸聚合測定法(Light transmission Aggreg-ometry，LTA)[4]。LTA可以測量不同濃度的激動劑刺激后，通過富含血小板的血漿(PRP)中傳輸?shù)墓狻．斞“迨艿酱碳r，由于血小板聚集，通過樣品的光傳播隨時間增加，因此可以被認為是血小板功能的可靠測量。但是，并非所有SPD患者均顯示LTA血小板聚集減少，這也很好地解釋了有些患者的LTA正常時仍然不能排除SPD。因此，在診斷時需結(jié)合別的檢測結(jié)果共同分析。雖然LTA是診斷不同嚴重PFD的重要檢測方法，但該檢測方法對診斷輕度PFD缺乏敏感性，總體敏感性估計在34%～60%之間。此外，LTA的主要缺點是研究血小板減少樣品中的血小板功能結(jié)果不可靠。其次是標準化較差，尤其是對于激動劑的濃度和數(shù)量的標準不統(tǒng)一，因此不同實驗室的檢測結(jié)果的一致性較差。不僅如此，LTA還需要較高的人力成本以及較多的全血量，因此不適用于新生兒和幼兒的PFD診斷[5]。

鑒于目前可用的檢測方法存在較大的缺陷，因此我們急需新的診斷PFD的方法，最好包括收集少量的血液。目前，流式細胞儀已被ISTH科學與標準化委員會推薦為診斷PFD的可靠診斷工具[3]。流式細胞術是一種應用廣泛、用途廣泛的技術，能夠用于研究血小板生物學功能等的許多方面。流式細胞術能夠檢測懸浮細胞中單個細胞的生物學特性，因此有助于快速分析大量血小板的功能和表型。流式細胞術相對于常規(guī)血小板功能測試的主要優(yōu)點是所需的全血量最少，并適用于血小板減少癥患者[6]。它利用熒光抗體快速分析單細胞上的多種細胞標記物，并且與LTA相比具有幾個優(yōu)點(表1)。當然，鑒于流式細胞儀存在一定的缺陷，目前只能在少數(shù)診斷實驗室作為一線實驗檢測手段。

表1 流式細胞術和LTA的優(yōu)點和缺點

2 血小板功能的流式細胞術檢測

2.1 實際問題 流式細胞術可以檢測一個樣品內(nèi)的不同血小板標記物，并且通過熒光染料或抗體分析特異性受體標記，可以很容易地將正常大小的血小板與其他血液成分(紅細胞和白細胞)分離開來。但是，當血小板識別僅基于前向散射和側(cè)向散射時，應注意避免溶血樣本，因為在含有大量細胞碎片或帶有氣泡的樣本中，檢測的結(jié)果會與血小板部分重疊，從而妨礙了準確的血小板識別。為了防止這些問題，應加入針對血小板特異性標記物(如GP1bα或CD41)的抗體，以幫助區(qū)分血小板與紅細胞或細胞碎片[7]。

2.2 血小板反應性測試 血小板功能測試應包括對導致血小板活化的信號傳導途徑的評估。最常見的相關途徑主要有通過GPVI刺激的膠原途徑、凝血酶途徑[蛋白酶激活受體1(PAR-1)和PAR-4起作用]、ADP途徑(嘌呤能受體P2Y12的作用)和血栓素A2途徑。這些途徑均可以用標準化的激動劑組來完成評估。比如，在流式細胞術中，測試膠原途徑的優(yōu)選激動劑是交聯(lián)的膠原相關肽。需要注意的是，用于評估血小板反應性的最佳激動劑濃度，在不同實驗室或不同測定目的中是不一樣的。例如，在出血性疾病的血小板功能測試時，需要高激動劑濃度來檢測血小板的反應性[8]。與LTA相比，一方面，由于流式細胞術允許基于中值熒光活性的完全定量分析，可以確定血小板的真正活化電位；另一方面，流式細胞術中較低的激動劑濃度或濃度梯度在血小板反應性增加的情況下更合適。

2.3 血小板分泌測試 使用整體電子顯微鏡對每個血小板的致密顆粒進行計數(shù)是診斷SPD的金標準[9]。但是，這種技術僅能在少數(shù)實驗室中使用，并且非常耗時。在血小板活化時，血小板表面能夠表達P-選擇素，CD63表達和溶酶體相關膜蛋白1(LAMP-1)等細胞標志物，而使用流式細胞術，可以相對容易地測量血小板的這些標記物的改變情況。因此，它們可以用作血小板活化的標志物。但是低CD63的表達不僅可由血小板活化、分泌引起，也可因為血小板致密顆粒的缺失引起，因此不足以診斷SPD。

靜息血小板中對麥帕克林(mepacrine)攝取的評估是流式細胞定量密集顆粒含量的另一種方法。mepacrine是一種熒光吖啶衍生物，對腺嘌呤核苷酸有很高的親和力，主要存在于血小板密集顆粒中。因此，mepacrine標記的致密顆粒可用流式細胞術進行定量。盡管SPD對mepacrine的吸收量較低，但該技術還沒有得到驗證，其診斷性能也沒有與其他SPD特異性診斷測試進行比較[10]。

3 當前流式細胞術在臨床環(huán)境中血小板功能測試的應用

3.1 輕微出血疾病的診斷 國際血栓和血液病學會最近公布了一項關于輕度出血障礙患者的診斷調(diào)查，共包括了37個國家的202個實驗室，發(fā)現(xiàn)有57%的實驗室使用流式細胞儀[11]，其中有23%實驗室用流式細胞儀作第一步測試，約有2/3的實驗室中用作第二步測試。其主要用途是研究罕見遺傳性血小板疾病如Glanzmann血小板無力和Bernard-Soulier綜合征中已知的受體表達水平。 在78個實驗室中，使用流式細胞儀研究α顆粒釋放、測量激活后P-選擇素的程度以及纖維蛋白原受體GPⅡb/Ⅲa的激活[但僅使用少量激動劑，通常是ADP和PAR1-AP(TRAP-6)]；另外還有不到30個實驗室進行了其他測試，比如致密顆粒釋放，促凝血活性或溶酶體釋放。值得注意的是，在每年調(diào)查的近14 000名患者中，60%的患者沒有發(fā)現(xiàn)異常，只有9%的患者接受了明確的分子診斷。這表明當前的檢查方法可能不足以指示疾病發(fā)生的潛在原因。

3.2 輸血醫(yī)學 流式細胞術通常用于輸血醫(yī)學，以研究血小板濃縮物在儲存期間的體外質(zhì)量，并評估不同的制備和儲存條件對血小板性質(zhì)的影響[12-13]。然而，大多數(shù)研究沒有涉及任何血小板激動劑的添加情況，而是研究了受體自發(fā)表達(gpib152155和GPⅡb/Ⅲa)、激活標記(p-selectin或CD63)和凋亡標記(annexin V)的變化[12，14]。目前，人們對激動劑誘導的表達以及它如何受儲存影響的知識相對較少。最近，研究人員提出激動劑誘導的微粒形成和LAMP-1暴露可以作為檢測儲存期間血小板功能惡化的潛在新標記物[15]。然而，這些發(fā)現(xiàn)如何與輸注血小板的體內(nèi)表現(xiàn)相關仍然是未知的。只有少數(shù)研究調(diào)查了血小板活化標志物的表達與體內(nèi)活力之間的相關性，但是迄今為止報道的相關性較低且研究之間存在差異。因此，使用流式細胞術研究血小板活化潛力可能有助于在這方面獲得更好的結(jié)果。

3.3 抗血小板藥物測試 目前，為了檢測血小板P2Y12受體的功能，研究者開發(fā)了一種商業(yè)的細胞流式檢測技術，目的是研究針對該受體的抗血小板藥物(如氯吡格雷、普拉格雷、替格列羅)的作用。在血管擴張劑刺激的磷蛋白(VASP)測定中，將血小板與前列腺素E1(PGE1)或ADP+PGE1一起溫育，并測量VASP的磷酸化狀態(tài)以確定活化P2Y12受體的程度。將該試驗與其他在臨床環(huán)境下測量P2Y12抑制的方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)“無應答者”的頻率與所進行的試驗有很大的不同[16]。另外，在一些研究中，這些分析之間的相關性很低[17]。有很多研究描述了檢測血小板GPⅡb/Ⅲa拮抗劑的直接或間接方法以及基于花生四烯酸檢測阿司匹林的方法，但沒有一種方法獲得廣泛關注或商業(yè)用途。最近的一項研究比較了流式細胞術和其他方法來確定雙抗血小板治療患者的血小板功能，發(fā)現(xiàn)各種不同的基于花生四烯酸的方法之間的相關性很低[18]，可能是花生四烯酸能夠裂解細胞，但這需要進一步研究證實。

4 小結(jié)

流式細胞術可以同時檢測血小板的性質(zhì)和功能，是為數(shù)不多的幾個血小板功能測試的方法之一。由于流式細胞術的許多實際優(yōu)點、在不同學科中的可能應用以及評估不同血小板功能的能力，PFD的診斷可能受益于流式細胞術。這種方法非常適用于血小板減少患者，因為僅僅只需要少量的血液。此外，還需要將流式細胞儀檢測結(jié)果與臨床結(jié)果結(jié)合起來進行研究，并與其他檢測進行比較研究。總之，流式細胞術可以增強疾病的診斷率，改善生活質(zhì)量和為治療策略的制定提高參考，并可能最終提高解析復雜基因型—表現(xiàn)型之間相關性的能力。