血清趨化因子CCL5和CXCL10在剛地弓形蟲急性感染早期診斷中的應(yīng)用

李文東 唐 娟 卓 衛(wèi)

福建省廈門市湖里區(qū)婦幼保健院 361009

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種寄生于有核細(xì)胞的原蟲。呈全球性分布，在我國(guó)的陽(yáng)性感染率為5%～10%[1]。弓形蟲是一種條件致病病原體，宿主在感染后多呈現(xiàn)出隱性或亞臨床癥狀。當(dāng)宿主免疫功能受損時(shí)，可由于全身性播散性異常增殖和中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累而導(dǎo)致死亡。感染弓形蟲是造成孕婦流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、畸形的重要病因之一[2]。

剛地弓形蟲可誘發(fā)宿主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，這對(duì)于抗弓形蟲感染有著重要作用。感染初期，最先產(chǎn)生應(yīng)答的是固有免疫反應(yīng)[3]。宿主的單核巨噬細(xì)胞通過表面的Toll樣受體識(shí)別弓形蟲抗原，誘導(dǎo)某些細(xì)胞因子及趨化因子的分泌。此種反應(yīng)產(chǎn)生于弓形蟲速殖子感染階段[4]。趨化因子的釋放有助于急性或者復(fù)發(fā)性弓形蟲病的炎癥浸潤(rùn)，在宿主免疫早期促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集于感染部位，進(jìn)而參與弓形蟲感染時(shí)的調(diào)控[5]，而趨化因子CCL5(C-C motif chemokine ligand 5)及CXCL10(C-X-C motif chemokine ligand 10)在弓形蟲感染患者免疫中的作用仍不清楚，其是否可用于弓形蟲感染聯(lián)合診斷研究較少。因此了解CCL5及CXCL10對(duì)于早期診斷弓形蟲感染、評(píng)估患者免疫能力有重要的臨床意義。

本研究選取44例弓形蟲感染患者的血清檢測(cè)其趨化因子CCL5、CXCL10的異常表達(dá)，分析其聯(lián)合檢測(cè)在早期診斷弓形蟲病的價(jià)值，并研究單個(gè)核細(xì)胞在弓形蟲感染中免疫應(yīng)答釋放CCL5及CXCL10的水平。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 (1)44例弓形蟲陽(yáng)性血清取自2013年5月—2018年5月本院住院及門診患者。其中IgM陽(yáng)性30例，IgG陽(yáng)性10例，IgM和IgG均陽(yáng)性4例，均為經(jīng)過進(jìn)口弓形蟲IgM和IgG檢測(cè)試劑復(fù)查篩選結(jié)果一致的血清，男24例，女20例，年齡20～55歲。同時(shí)選取來(lái)自本院健康體檢者待檢陰性血清40份，男20例，女20例，年齡20～55歲。(2)單個(gè)核細(xì)胞抽提用全血來(lái)源為10例健康體檢人群，5例IgG陽(yáng)性患者。(3)實(shí)驗(yàn)所用蟲株為剛地弓形蟲RH株，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保種。

1.2 主要試劑與儀器 CCL5及CXC10的ELISA試劑盒購(gòu)為美國(guó)R&D公司。細(xì)胞用培養(yǎng)基為美國(guó)Hyclone,胎牛血清、雙抗為美國(guó)Gibco。淋巴細(xì)胞分離液Ficoll為Solarbio。酶標(biāo)儀為美國(guó)BioTek酶標(biāo)儀。

1.3 方法 (1)人單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的提取。將5ml新鮮抗凝血與5ml無(wú)菌生理鹽水充分混勻，沿管壁緩慢疊加于10ml淋巴細(xì)胞分離液Ficoll，水平離心1 500rpm,15min。離心后離心管內(nèi)分為3層，用移液管吸取懸于中間的白色渾濁層置于另一離心管中，加入10ml PRMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100U/ml青霉素， 100U/ml鏈霉素)，洗滌細(xì)胞2次。棄去上清，加入10ml 5% 小牛血清PRMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)弓形蟲感染單個(gè)核細(xì)胞模型的建立。計(jì)數(shù)2×106單個(gè)核細(xì)胞/孔于RPMI-1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。單個(gè)核細(xì)胞分為2組，a組為培養(yǎng)基培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞24h作為陰性對(duì)照，b組為單個(gè)核細(xì)胞與剛地弓形蟲速殖子10∶1共培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)液上清待測(cè)。(3)趨化因子CLL5與CXCL10的檢測(cè)。采用美國(guó)R&D ELISA試劑盒檢測(cè)血清及細(xì)胞培養(yǎng)上清中的CLL5及CXCL10含量。根據(jù)說(shuō)明書要求準(zhǔn)備試劑，并將血清進(jìn)行50倍稀釋，細(xì)胞液進(jìn)行10倍稀釋，分別配置標(biāo)準(zhǔn)品。加樣后室溫孵育2h,棄去液體，洗滌液洗3遍后加入CLL5/CXCL10抗體，室溫孵育2h后洗3遍，加入底物后室溫避光孵育30min，加入終止液，使用美國(guó)BioTek酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，記錄結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 剛地弓形蟲感染患者及健康對(duì)照組血清中CCL5與CXCL10的水平比較 剛地弓形蟲感染患者的血清CCL5、CXCL10水平明顯高于健康對(duì)照組。IgM單陽(yáng)性患者為急性感染期，其血清CCL5、CXCL10水平較健康人水平高(t=9.168,t=7.699,P<0.01),且較IgG單陽(yáng)性患者，即既往感染患者血清CCL5、CXCL10水平高(t=3.518,P<0.01；t=2.392,P<0.05)，各組間結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、圖1。

表1 剛地弓形蟲感染組及健康對(duì)照組血清CCL5和CXCL10水平的比較

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.01；與IgG陽(yáng)性組比較，#P<0.05。

圖1 剛地弓形蟲感染組及健康對(duì)照組血清中CCL5和CXCL10的水平測(cè)定

2.2 剛地弓形蟲感染患者血清CCL5和CXCL10水平相關(guān)性分析 剛地弓形蟲感染患者(IgM陽(yáng)性、IgG陽(yáng)性、IgM和IgG雙陽(yáng)性)血清中CCL5和CXCL10含量呈明顯正相關(guān)(r=0.46，P<0.01)，見圖2。

圖2 剛地弓形蟲感染患者血清CCL5和CXCL10水平相關(guān)性分析

2.3 剛地弓形蟲速殖子和人單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)培養(yǎng)基趨化因子水平的檢測(cè) 為比較人PBMC在早期感染剛地弓形蟲與既往感染PBMC再次感染弓形蟲時(shí)分泌趨化因子CCL5與CXCL10的水平，該實(shí)驗(yàn)將正常人PBMC與IgG陽(yáng)性患者PBMC分別與RH株剛地弓形蟲速殖子共培養(yǎng)，檢測(cè)其細(xì)胞上清CCL5及CXCL10水平。與速殖子共培養(yǎng)后，正常PBMC及患者PBMC分泌CCL5和CXCL10含量較陰性對(duì)照組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.138,t=3.070,P<0.01)。正常PBMC分泌CCL5和CXCL10較患者PBMC高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2，圖3。

表2 PBMC與RH株弓形蟲速殖子共培養(yǎng)細(xì)胞上清CCL5和CXCL10水平的比較

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.01。

圖3 PBMC與RH株弓形蟲速殖子共培養(yǎng)細(xì)胞上清CCL5和CXCL10水平測(cè)定

2.4 血清CCL5和CXCL10檢測(cè)聯(lián)合診斷剛地弓形蟲早期感染的價(jià)值 通過繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，血清CCL5和CXCL10聯(lián)合診斷弓形蟲早期感染曲線下面積為0.872，95%可信區(qū)間為0.822～0.962，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.036，P<0.01，敏感度為0.88，特異度為0.864，約登指數(shù)為0.744，見圖4。

圖4 血清CCL5和CXCL10聯(lián)合診斷弓形蟲感染的ROC曲線

3 討論

弓形蟲是一種可入侵有核細(xì)胞的機(jī)會(huì)致病原蟲。免疫功能正常的人群感染弓形蟲后，臨床過程具有自限性，少見明顯的癥狀。然而對(duì)于結(jié)核病、腫瘤或器官移植等免疫功能受損或低下的患者，弓形蟲的感染則可引起嚴(yán)重的臨床癥狀[6]。此外，孕婦感染弓形蟲后，可通過胎盤導(dǎo)致畸胎、早產(chǎn)或死胎等嚴(yán)重并發(fā)癥，因此孕前或妊娠期弓形蟲感染的早診斷、早治療，具有相當(dāng)重要的優(yōu)生優(yōu)育意義[7]。目前臨床常用檢測(cè)弓形蟲IgG和IgM來(lái)對(duì)弓形蟲感染進(jìn)行診斷，但該檢測(cè)方法具有一定的局限性，如患者處于感染灰區(qū)時(shí)間，且若患者免疫力低下等均會(huì)造成檢測(cè)的假陰性，用于該法檢測(cè)的單克隆抗體多為小鼠抗體，若樣本內(nèi)存在抗小鼠抗體等嗜異性抗體會(huì)造成結(jié)果的假陽(yáng)性，故臨床急需利用多項(xiàng)目聯(lián)合檢測(cè)以提高弓形蟲病的早期診斷率及敏感性。本研究則通過對(duì)弓形蟲患者的血清趨化因子CCL5及CXCL10分析，發(fā)現(xiàn)弓形蟲病患者血清CCL5、CXCL10水平明顯高于正常人，且在早期感染患者血中呈高水平分布，與感染階段密切相關(guān)， 此發(fā)現(xiàn)說(shuō)明CCL5、CXCL10聯(lián)合診斷在弓形蟲早期感染診斷中的價(jià)值。同時(shí)，本研究采用體外實(shí)驗(yàn)方法共培養(yǎng)PBMC和RH弓形蟲速殖子，檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞在急性弓形蟲感染和復(fù)發(fā)感染情況下CCL5及CXCL10的水平，發(fā)現(xiàn)首次感染初期PBMC分泌CCL5及CXCL10水平明顯高于已感染過弓形蟲患者的PBMC分泌水平，進(jìn)一步奠定了血液、體液中CCL5、CXCL10含量用于檢測(cè)弓形蟲早期感染的診斷價(jià)值。

趨化因子是一類在炎癥反應(yīng)中可誘導(dǎo)白細(xì)胞募集和激活的多肽蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量8～10kD[5]。根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)中N-末端半胱氨酸殘基的相對(duì)位置可分為CXC(α)、CC(β)、C(γ)、CX3C(δ)四個(gè)亞家族，至今已發(fā)現(xiàn)超過60種。趨化因子是通過結(jié)合細(xì)胞膜表面不同類型的趨化因子受體而發(fā)揮作用的，一方面趨化因子定向募集白細(xì)胞在感染局部發(fā)揮抗感染作用，另一方面其誘導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)易造成局部的組織損傷[8]，故趨化因子有助于控制弓形蟲的感染。不同類型的趨化因子可選擇性作用于免疫細(xì)胞，引起定向遷移。趨化因子CCL5[9]是CC趨化因子家族成員之一，主要定向趨化和激活T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。通過與其相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮多種不同的生物學(xué)功能，調(diào)節(jié)免疫炎癥進(jìn)程。在抗感染免疫中起重要作用。炎癥反應(yīng)中多種細(xì)胞可分泌CCL5，引起CCL5表達(dá)水平的升高[10]。CXCL10又名IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10(IFN-γ-inducible protein10，IP-10)[11-12]，主要通過與趨化因子受體3結(jié)合，發(fā)揮炎癥趨化作用。作為T細(xì)胞特異性活化趨化誘導(dǎo)劑，促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞募集，發(fā)揮抗弓形蟲作用，從而影響弓形蟲感染的進(jìn)程。對(duì)CXCL10的檢測(cè)同時(shí)可了解弓形蟲感染的進(jìn)展。Akitoshi等人[13]發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠感染眼弓形蟲病后， CCL5和CXCL10表達(dá)均升高。Gopal等人[14]在發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞感染剛地弓形蟲后，CCL5和CXCL10的水平也會(huì)升高。但目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)多采用動(dòng)物模型進(jìn)行研究，本研究采用對(duì)患者血清CCL5和CXCL10水平檢測(cè)，討論其在臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值，并探討弓形蟲感染PBMC，亦影響CCL5和CXCL10水平。

綜上所述，血清趨化因子CCL5及CXCL10的調(diào)控在弓形蟲早期感染中發(fā)揮重要作用，其血清含量的檢測(cè)作為一種方便、經(jīng)濟(jì)的生物標(biāo)志物可作為弓形蟲早期感染的輔助診斷標(biāo)志物，與弓形蟲抗體聯(lián)合診斷有助于弓形蟲病的早診斷早治療。