貝萊斯芽孢桿菌的內切葡聚糖酶基因的克隆、表達及其酶學性質分析

陳 龍，吳興利，閆曉剛，谷 巍，徐海燕，錢愛東，王春鳳，張芳毓*

（1.吉林省農業科學院畜牧科學分院，吉林公主嶺 136100；2. 山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安 271000；3. 吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春 130118）

纖維素水解一直是人們關注的焦點和研究的熱點[1]。通常，內切葡聚糖酶（CMCase，EC 3.2.1.4）主要參與纖維素分解的初始階段，與外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.91）和β- 葡糖苷酶（EC 3.2.1.21）以協同作用的方式誘導纖維素完全水解生成葡萄糖[2-3]。目前，內切葡聚糖酶被成功應用于洗滌劑[4-6]、動物飼料[7-9]、紙漿和造紙工業中[10]。芽孢桿菌具有較高的生長速率和較短的發酵周期，且是生產纖維素酶的重要種屬之一[11-14]。據報道，芽孢桿菌的纖維素酶屬于糖基水解酶5（GH5）家族[15]，研究人員已嘗試在異源宿主大腸桿菌中進行克隆并表達纖維素酶基因[10]。雖然大腸桿菌因易于遺傳操作，是重組蛋白生產的理想宿主，但在大腸桿菌中進行纖維素酶基因的表達存在2 個亟待解決的問題：第一，將重組蛋白質分泌到細胞外培養基中一直是阻礙其直接工業化應用的難題[10]；第二，在工業化生產過程中，高溫導致內切葡聚糖酶活性降低[16]，內切葡聚糖酶活性受纖維素酶自身特性和高溫等環境壓力的影響[17-18]。因此，對具有高活性和熱穩定性的重組內切葡聚糖酶的研究仍在繼續[19]。

在前期研究中，本實驗室從杜仲樹皮內分離到一株B. velezensis 157，具有較高的內切葡聚糖酶活力[20-21]。本研究對編碼B. velezensis 157 的內切葡聚糖酶基因在大腸桿菌進行克隆和表達，并對重組酶進行表征。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 B. velezensis 157 由本實驗室分離并保存，Peasy-Blunt Cloning Kit 克隆載體購自TaKaRa公司，Trans1-T1 宿主菌購自北京全式金公司，pET-32a表達載體，BL21（DE3）宿主菌由本實驗室保存。

1.2 目的基因的克隆與序列分析 取適量純化培養后B. velezensis 157 菌液，根據AXYGEN 細菌基因組DNA提取試劑盒（購自AXYGEN 公司）的說明書進行操作。根據NCBI 上已登錄的芽孢桿菌屬內切纖維素酶基因序列（登錄號：KY797654），應用Primer Premier 7.0 軟件設計1 對特異性引物：C1： CCATGAAAC GGTCAATTTCTATTTTTA；C2：CGCTAATT GGGT TCT GTACCCCAAATC。其中下劃線部分分別為Bam HI 和Hind III 限制性內切酶切位點。PCR 反應體系為25 μL：0.5 μL 引物C1（濃度為0.25 μmol/L）、0.5 μL 引物C2（濃度為0.25 μmol/L）、2 μL dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸，濃度為1.25 mmol/L）、2.5 μL10×PCR 緩 沖 液（10mmol/L）、0.25 μL Ex Taq 酶（2.5 U/μL）、1 μL B. velezensis 157 基因組DNA、補充雙蒸水至25 μL。DNA marker、Ex Taq 聚合酶、Bam HI 和Hind III 限制性內切酶、T4 連接酶均購自TaKaRa 公司。

預變性、變性、退火、延伸的反應參數分別為94℃5 min、30 個循環（94℃ 1 min、52℃ 1 min、72℃ 1 min）、72℃ 10 min。取2 μL PCR 產物經凝膠電泳檢測，利用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒（購自AXYGEN 公司）對產物進行純化回收，PCR 產物交由庫美公司進行測序。測序結果利用BLAST 序列同源性分析，ORF Finder 軟件進行開放閱讀框分析，利用NCBI 中BLASTX 程序與已知芽孢桿菌屬內切纖維素酶基因進行比對，利用MEGA7.0 軟件構建內切葡聚糖酶基因的系統發育樹。內切葡聚糖酶氨基酸序列通過EXPASY、Signal P 3.0 Server、Pfam、CLC sequence Viewer 7.5、Illustrator for biological sequences 等軟件進行分析[23]。

1.3 pEASY-157-CMCase 克隆質粒的構建 將CMCase基因的DNA 回收產物與Peasy 載體連接，連接產物進行Trans1-T1 轉化等均按照p EASY-Blunt Cloning Kit使用說明操作。將內切葡聚糖酶基因的克隆質粒稱為pEASY-157-CMCase，提取質粒（質粒小提試劑盒購自TIANGEN 公司）經PCR 驗證后，送至庫美公司測序鑒定。連接反應體系包括4 μL PCR 產物和1 μL pEASYBlunt 克隆載體。

1.4 pET32a-157-CMCase 表達質粒的構建 取實驗室凍干保存的含pET32a 質粒的宿主菌DH5α 進行復蘇，用液體LB 搖菌培養后提取質粒，-20℃保存備用。分別利用Bam HI 和Hind III 限制性內切酶，對測序正確的pEASY-157-CMCase 克隆質粒與pET32a 質粒進行雙酶 切，37 ℃水 浴4 h。50 μL 體 系：43 μL pEASY-157-CMCase 質粒、5 μL 10×Buffer（1×K）、1 μL Hind III、1 μL Bam H I。分別回收內切纖維素酶片段和pET-32a空載體，用T4 連接酶將目的片段與空載體連接，16℃金屬浴中過夜連接，10 μL 體系：6 μL157-CMCase 目的基因、1 μL10×連接酶緩沖液、1 μL T4 連接酶和2 μL pET32a 載體。將過夜連接的重組pET32a-157-CMCase表達質粒先進行DH5α 感受態轉化，利用氨芐青霉素抗性篩選單菌落并進行提質粒、PCR 以及雙酶切驗證，并送至庫美公司測序。將測序正確的重組質粒，轉化至表達宿主菌BL21（DE3）并驗證，并命名pET32a-157-CMCase BL21（DE3）。

1.5 ET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌的表達

1.5.1 重組pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌的誘導表達與可溶性分析 將構建好的pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌，以1%轉接入100 mL 的液體LB（含Amp）培養至對數期。加入0.4 mmol/L IPTG 誘導8 h 后，于4℃ 12 000 r/min 離心20 min，洗菌3 次，進行超聲破碎10 min（工作時間3 s，間隔時間3 s，總定時次數200），取超聲破碎產物經12 000 r/min，4℃離心20 min 后，將沉淀和上清分別與等量的2×蛋白上樣緩沖液混合，經沸水煮沸10 min 后進行SDSPAGE 檢測，廣譜蛋白Marker 購自北京全式金公司。

1.5.2 重組pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌的誘導表達優化、產酶部位確定及纖維素酶平板檢測 間優化：將重組pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌以1%含量接入多瓶液體LB（含Amp）培養至對數期，設置非誘導對照組，其余試驗組加入0.4 mmol/L IPTG后于37℃ 分別誘導2、4、6、8、10 h，取適量誘導后的菌液超聲破碎處理后進行SDS-PAGE 檢測。IPTG 濃度的優化：將IPTG 的濃度設定為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的IPTG，誘導10 h 后，菌液經超聲破碎處理后進行SDS-PAGE 檢測。

取經優化誘導的重組pET32a-157-CMCase BL21（DE3）宿主菌菌液15 mL，12 000 r/min，4℃離心20 min，上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，收集上清液作為上清組；加入PBS 緩沖液加到原體積重懸菌體進行超聲破碎處理，工作時間3 s，間隔時間3 s，總定時次數200，破碎后于12 000 r/min，4℃離心20 min，上清液即為破碎菌體粗酶液；將誘導后的原菌液直接進行超聲破碎處理即為上清液+菌體組。利用DNS 測定這3 部分的內切纖維素酶活力，確定纖維素酶產生部位[10]。最后通過剛果紅染色法檢驗纖維素酶水解圈。上述試驗均平行操作3 次，以平均值±標準誤表示。

1.6 內切纖維素的酶活性測定 參考文獻[21]配置葡萄糖標準溶液，測定其OD540nm值，繪制葡萄糖標準溶液的標準曲線。上清粗酶液的制備參考方法1.5.2。采用DNS 法檢測內切纖維素酶活力以及DNS 的配置參考文獻[24]：以0.05 mol/L，pH 為 5.0 的檸檬酸緩沖液作為溶劑，配置含1% 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）的底物溶液。取100 μL 底物與50 μL 粗酶液充分混合，于50℃恒溫條件下水浴30 min，之后加入200 μL DNS 溶液終止反應，在沸水中煮沸5 min，冰水中冷卻，加入1 mL蒸餾水混勻，取其中300 μL 加入酶標板，用酶標儀測定540 nm 下吸光值。每分鐘底物被酶解產生1 μmol葡萄糖所需酶量定義為一個酶活力單位（IU）。

1.7 重組纖維素酶菌株的酶學性質分析

1.7.1 內切葡聚糖酶酶促反應的最適溫度與熱穩定性 在pH 為 5.0 的條件下，將粗酶液與檸檬酸緩沖液混合后，分別以30～90℃為反應溫度作用30 min，分別測定相應內切葡聚糖酶酶活，最高酶活值記為100%，計算出各個溫度下的相對酶活，確定出最適反應溫度。在pH 5.0 的條件下，將粗酶液分別于40～90℃不同溫度條件下保持30 min 和60 min 后，待粗酶液溫度恢復至室溫，以標準條件（pH 為5.0，60℃作用30 min）下測定殘余內切葡聚糖酶酶活，同時以標準條件下粗酶液的內切葡聚糖酶酶活為100%，計算得出相對酶活，以此確定內切葡聚糖酶酶活的熱穩定性。

1.7.2 內切葡聚糖酶酶促反應的最適p H 與p H 穩定性 在60℃的條件下，將粗酶液分別與pH 為4、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的緩沖劑的底物（1% CMC-Na）混合，作用30 min，然后測定在這些pH 條件下的內切葡聚糖酶酶活，以酶活最高值記為100%，計算出各個pH 下的相對酶活，確定出最適反應pH。將粗酶液分別于p H 為4、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的緩沖劑中60℃保持30 min 和60 min 后，以標準條件（pH 為5.0，60℃作用30 min）下測定殘余內切葡聚糖酶酶活，同時以標準條件下粗酶液的內切葡聚糖酶酶活為100%，計算得出相對酶活，確定內切葡聚糖酶的p H 穩定性。

1.7.3 各種金屬離子和化合物對內切葡聚糖酶的影響 配置10 mmol/L 的 金 屬 離 子（BaCl2、CaCl2、NaCl、HgCl2、FeCl2、MgCl2、MnCl2、CoCl2、ZnCl2、CuCl2、KCl）；酶抑制劑（10 mmol/L EDTA、10 mmol/L 尿素、10 mmol/L β-疏基乙醇、1 mmol/L DMSO、1 mmol/L DEPC、1 mmol/L PMSF、10 mmol/L DTT），1%（v/v）的表面活性劑（Triton-X-100、Tween-20、Tween-80、SDS），緩沖劑是0.05 mol/L p H 5.0 的檸檬酸緩沖液。測定粗酶液分別與上述溶液混合保持60 min 后的酶活。以標準條件下粗酶液的內切葡聚糖酶酶活為100%，計算得出相對酶活，以此確定各種金屬離子和化合物對內切葡聚糖酶酶活的影響。

1.7. 4 內切葡聚糖酶底物專一性的測定 分別以用0.05 mol/L，pH 5.0 的檸檬酸緩沖劑配置的1%CMC-Na、水楊苷、木聚糖、Whatman 濾紙、纖維二糖、微晶纖維素作為底物，測定內切葡聚糖酶對不同底物的酶活，確定內切葡聚糖酶的底物專一性。

1.8 統計分析 數據處理采用Graph Prism 7.0 軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）并繪制折線圖和柱狀圖，數據用平均值±標準誤表示。

2 結 果

2.1 B. velezensis 157 內切葡聚糖酶基因的原核表達

2.1.1 B. velezensis 157 內切葡聚糖酶基因的克隆與序列分析 以提取的B. velezensis 157 基因組為模板，經PCR、瓊脂糖凝膠電泳和測序分析，獲得與預期片段大小相符的1 500 bp（圖1）。

圖1 B. velezensis 157 內切葡聚糖酶的PCR 擴增

2.1.2 B. velezensis 157 內切葡聚糖酶基因的進化樹分析 將 B. velezensis 157 內切葡聚糖酶基因經Blast 檢測比對，應用MEGA 7.0 軟件構建NJ 系統發育樹。如圖2 可見，B. velezensis 157 的內切葡聚糖酶蛋白自成一支；與B. velezensis SCGB 574 （CP023431.1）、B. velezensis JS25R （CP009679.1）、B. velezensis NAU-B3（HG514499.1）的內切纖維素酶基因相似度較高。

圖2 B. velezensis 157 內切葡聚糖酶基因的進化樹分析

2.1.3 重組內切葡聚糖酶基因的蛋白序列分析及結構預測 纖維素酶蛋白一級結構在線預測結果表明由499 個氨基酸組成，分子式為C2447H3788N678O754S8，預測分子量為55.02 ku，理論等電點（pI）為8.71，帶負電荷的殘基總數為52，帶正電荷的殘基總數為57。纖維素酶基因最大開放閱讀框ORF 分析基因大小為1 500 bp，已ATG 為起始密碼子，TAG 為終止密碼子。應用PSIPRED 3.3 蛋白質二級結構預測，coil 無規則卷曲共計226 個氨基酸占45.29%，a- 螺旋共142 個氨基酸占28.45%，β-折疊共131 個氨基酸占26.25%。蛋白質三級結構分析，應用Swiss-Model Workspace 同源建模，由于B. velezensis 157 的內切纖維素酶基因與Bacillus sp. 3pzt.1.A 序列相似度為96.08%。因此，以3pzt.1.A序列為模板進行同源建模，3D 模型見圖3。

圖3 B. velezensis 157 內切葡聚糖酶的預測蛋白三級結構

信號肽分析：基于Y-Max 判定，最可能的剪切位點預測在第29 和第30 之間，第30 位為最理想的剪切位點，成熟蛋白啟動的位置30 位，本蛋白具有信號肽。親疏水性分析：經ProtScale 軟件對蛋白質親疏水性的分析發現，在13 氨基酸位點處具有1 個疏水區，在143 氨基酸位點具有1 個親水區域。跨膜區分析：應用TMHMM 2.0 軟件進行跨膜區分析，1～4 位氨基酸位于細胞內部，5～27 位氨基酸之間形成一個典型的跨膜螺旋區，28～499 位氨基酸位于細胞膜表面，表明B. velezensis 157 的內切纖維素酶可能是一個與細胞信號傳導有關的膜受體蛋白。

利用Illustrator for Biological Sequences （IBS）軟件內切葡聚糖酶蛋白結構進行分析。由圖4 可見，5～27 氨基酸編碼跨膜區域，50～297 氨基酸編碼纖維素酶區域，屬于糖苷水解酶GH5 家族（EC 3.2.1.4），356～437 氨基酸編碼碳水化合物結合模塊，其中9～445 氨基酸編碼BglC 基因。

圖4 B. velezensis 157 內切葡聚糖酶的蛋白結構示意圖

2.2 原核表達質粒pET32a-157-CMCase 的構建與鑒定 利用純化內切葡聚糖酶基因構建pET32a-157-CMCase質粒，經雙酶切和PCR 法鑒定發現，在1 500 bp 處的條帶與目的基因大小相符的條帶（圖5）。

2.2.1 重組內切葡聚糖酶基因表達條件的優化及可溶性分析 經IPTG 和時間誘導優化后，用SDS-PAGE 檢測蛋白表達情況。從圖6 和圖7 可以看出，隨著誘導物濃度增加表達量無明顯變化，且加入0.4 mmol/L 誘導劑時菌株表達量最佳；菌株表達量最佳誘導時間為8 h。

圖5 重組質粒pET32a-157-CMCase 的雙酶切鑒定

圖6 重組質粒pET32a-157-CMCase 誘導劑最佳濃度的SDS-PAGE 分析

圖7 重組質粒pET32a-157-CMCase 誘導劑最佳時間的SDS-PAGE 分析

2.2.2 葡萄糖標準曲線及回歸方程 葡萄糖標準曲線的擬合方程為y=0.462x－0.085，標準曲線的線性相關系數為0.999，符合標準曲線的要求，可以用于后續酶活力計算。

2.2.3 重組內切葡聚糖酶的胞內外分析 由圖8 可見，重組pET32a-157-CMCase 蛋白在上清中可檢測到纖維素酶活力為5.81 IU/mL，細菌沉淀中為1.61 IU/mL；誘導后原菌液直接超聲破碎處理纖維素酶活力可達7.41 IU/mL，其酶活力為野生菌株B. velezensis 157的2.3倍（P＜0.000 1），說明重組菌株p ET32a-157-CMCase 可進行纖維素酶表達，且產生的纖維素酶主要進行分泌表達。因此，后續采用誘導后上清液可直接進行重組纖維素酶活的分析。

圖8 重組內切葡聚糖酶的胞內外分析

2.2.4 重組內切葡聚糖酶的CMC 平板驗證 重組pET32a-157-CMCase 蛋白能夠在CMC-Na 篩選平板上生長，且經過剛果紅染色后，出現明顯的透明圈（圖9），證明重組菌株具有分泌內切葡聚糖酶力的能力。

圖9 重組內切葡聚糖酶的羧甲基纖維素鈉篩選平板驗證

2.2.5 重組內切葡聚糖酶的酶學性質分析

2.2.5.1 重組內切葡聚糖酶的最適反應溫度、pH 以及溫度和pH 的穩定性 重組內切葡聚糖酶的最適酶反應溫度和p H 分別為50℃和6（圖10-a 和10-c）。重組內切葡聚糖酶的溫度穩定性（圖10-b）結果發現，溫度在40～50℃時，相對剩余酶活力均高于90%，隨著溫度升高酶活逐漸降低，當溫度高于60℃，酶活力相對剩余酶活約為75.87%（30 min），隨著作用時間的延長，酶活力下降到72.13%（60 min）。重組內切葡聚糖酶pH 穩定性（圖10-d）結果發現，在p H 為5 時，相對酶活力約為86.45%左右；在p H 6～10 時耐受性良好，相對剩余酶活力均高于90%；隨作用時間的延長，對相對剩余酶活力影響不大。

2.2.5.2 不同金屬離子及添加劑對重組內切葡聚糖酶的影響 由表1 可知，Na+、Mg2+、Mn2+可以促進重組內切葡聚糖酶，而Co2+、Zn2+、Hg2+、Fe2+、Cu2+等金屬離子抑制內切葡聚糖酶。表面活性劑SDS 和DTT 抑制重組內切葡聚糖酶。

圖10 重組內切葡聚糖酶的最適反應溫度（a）、pH（c）及溫度（b）和pH（d）穩定性

2.2.5.3 重組內切葡聚糖酶的底物專一性 從表2 可發現，對羧甲基纖維素鈉具有最高的酶活力，同時對微晶纖維素、纖維二糖、木聚糖、濾紙、水楊苷均有一定酶活力，對水楊苷酶活力利用能力最低。表明重組內切葡聚糖酶具有典型內切纖維素酶的特征。

表1 各種金屬離子和化學試劑對重組內切葡聚糖酶的影響 %

表2 重組內切葡聚糖酶的底物專一性 %

3 討 論

B. velezensis 157 是一株能夠分泌多種木質纖維素酶的芽孢桿菌，包括：內切葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、果膠酶等[21]。本研究中，B. velezensis 157 的胞外內切葡聚糖酶可達3.24 IU/mL，但胞外提取物成分復雜，不利于回收，限制了其在工業上的應用。纖維素酶在外源宿主中的過表達是解決野生菌株纖維素酶產量低、難回收等問題的優良替代方法。本研究中，重組內切葡聚糖酶產量與野生菌株相比，增加了2.3 倍，說明大腸桿菌系統的重組表達水平更高，有望代替野生菌株作為細胞工廠生產纖維素酶制劑，將纖維素生物質轉化為可發酵糖[24]。此外，本實驗還發現胞外分泌的纖維素酶活性比胞內纖維素酶活性高，在開發重組纖維素酶方面具有關鍵意義。目前，胞外纖維素酶產量高且能夠進行胞外分泌表達的報道有限，重組纖維素酶的開發面臨困難重重。Kim 等[25]報道，B. circulans 和B. licheniformis中內切葡聚糖酶可在大腸桿菌表達系統中100%進行胞外分泌表達。與上述報道相反，Koide 等[26]對來自B. subtilis IF03034 的內切葡聚糖酶進行大腸桿菌克隆和表達，發現其胞外內切葡聚糖酶活性僅為25%。而來自B. subtilis DLG 的內切葡聚糖酶在大腸桿菌中胞外分泌表達甚至更少（約1%），且重組內切葡聚糖酶大部分存在于胞質周間或胞質膜內[27]。本實驗對重組內切葡聚糖酶進行胞內外分析發現，重組內切葡聚糖酶在上清中可檢測到纖維素酶活力為5.81 IU/mL，細菌沉淀中為1.61 IU/mL，誘導后原菌液直接超聲破碎處理纖維素酶活力可7.41 IU/mL。本研究結果與Pandey 等[10]報道的重組一株Bacillus subtilis IARI-SP-1 的內切葡聚糖酶結果相似，其重組內切葡聚糖酶在上清中可檢測到纖維素酶活力為8.2 IU/mL，細菌沉淀中為2.8 IU/mL，誘導后原菌液直接超聲破碎處理纖維素酶活力可10 IU/mL。因此，說明重組Bacillus velezensis 157 的內切葡聚糖酶可進行誘導表達，且產生的纖維素酶主要進行分泌表達，從SDS-PAGE 得到的重組葡聚糖酶分子量約為55 ku，與其他芽孢桿菌報道的內切葡聚糖酶的分子量相似[28～29]。此外，重組內切葡聚糖酶能夠在CMC 篩選平板上生長，且經過剛果紅染色后，出現明顯的透明圈，再次證明重組內切葡聚糖酶在BL21 菌株中可進行胞外分泌表達。Yang 等[28]也利用剛果紅染色法驗證重組pET25bcelI15 菌株的胞外內切纖維素酶活性。重組蛋白的胞外分泌生產比胞質周間或胞質膜內更具有優勢。細胞外生產不需要裂解細胞外膜來獲得目標蛋白，可連續生產重組蛋白。因此，大腸桿菌系統可用于細胞外生產內切葡聚糖酶，用于后續內切葡聚糖酶的表征。

本實驗結果表明，重組內切葡聚糖酶的最適酶反應溫度和pH 分別為50℃和6，在40～60℃具有一定的溫度耐受性，在pH 6～10 范圍內具有較好的pH 耐受性；重組內切葡聚糖酶溫度穩定性結果發現，在60℃放置1 h，相對剩余酶活力高于70% 以上，表明重組內切葡聚糖酶具有一定的耐熱性，適用于制漿行業等需要較高溫度的工業化生產。但其酶的穩定性低于Yang 等[28]報道的重組Bacillus subtilis I15 的內切葡聚糖酶，在65℃放置2 h 仍可保持90%以上的相對剩余酶活力。重組內切葡聚糖酶的pH 穩定性可以看出，在p H 為5 時，相對酶活力約為86.45%左右，在p H 6～10 時耐受性良好，相對剩余酶活力均高于90%，隨作用時間的延長，對相對剩余酶活力影響不大。重組內切纖維素酶p H 穩定性高于Bacillus subtilis IARI-SP-1[10]、 B. licheniformis AU01[13]、B. amyloliquefaciens DL-3[12]和B. subtilis A-53[25]等的報道。各種金屬離子和化學試劑對重組內切葡聚糖酶的影響結果發現，Na+、Ca2+、Mg2+可以促進重組內切葡聚糖酶，而Co2+、Zn2+、Hg2+、Fe2+、Cu2+等金屬離子和表面活性劑SDS 抑制重組內切葡聚糖 酶。Zafar[30]報道，重組Bacillus subtilis JS2004 的內切葡聚糖酶，Ca2+、Mg2+、Tween 20 能夠激活重組內切葡聚糖酶酶活，而Ni2+、Hg2+、Zn2+、Cu2+以及SDS抑制其酶活力，與本實驗結果相一致。重組內切葡聚糖酶的底物專一性實驗發現，對羧甲基纖維素鈉具有最高的酶活力，同時對微晶纖維素、纖維二糖、木聚糖、濾紙、水楊苷均有一定酶活力，表明重組內切葡聚糖酶具有典型內切纖維素酶特征，且具有利用底物廣的特點。本實驗結果與Hakamada 等[31]報道的Bacillus sp. KSM-S237 結果相似。

4 結 論

本實驗成功將野生菌株B. velezensis 157 的內切葡聚糖酶在大腸桿菌系統中進行克隆和表達，成功構建了分泌型重組內切葡聚糖酶的大腸桿菌，并進行酶學性質分析。重組內切葡聚糖酶的分子量約為55 ku，經0.4 mmol/L IPTG 和8 h 誘導表達優化后，在培養上清、菌體以及直接超聲破碎的原菌液中可檢測到內切葡聚糖酶活力分別為5.81、1.61、7.41 IU/mL，為野生菌株內切葡聚糖酶的2.3 倍。重組內切葡聚糖酶具有典型內切纖維素酶的特征，其最適酶反應溫度和pH 分別為50℃和6，在40～60℃具有一定的溫度耐受性，在pH 6～10 范圍內具有較好的pH 耐受性。Na+可以促進重組內切葡聚糖酶活力，而Co2+、Hg2+、Fe2+等金屬離子以及表面活性劑SDS 具有較強的抑制作用。本實驗室正試圖利用纖維素酶的過表達進行大規模生產，作為纖維素酶制劑用于動物生產。預計還將進一步地進行實驗條件優化，以便最大限度地將生物質材料轉化為可發酵糖。