SLC45A2 基因在“豫粉1 號”淺蘆花羽色中的表達(dá)及酪氨酸對其在黑色素細(xì)胞中表達(dá)量的影響

宋素芳，宋幸輝，藺成剛，李東華，王鑫磊，孫桂榮

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物科技學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002）

羽色是家禽最顯著的表型特征之一，在家禽育種中是一個重要的育種性狀。“豫粉1 號”蛋雞H 系具有淺蘆花羽色性狀，成年雞頸部背部毛色為淺蘆花羽色，頸腹側(cè)為白色羽毛，具有伴性遺傳特點，可作為羽色自別雌雄的重要分子遺傳標(biāo)記。淺蘆花羽色性狀作為“豫粉1 號”蛋雞的典型特征備受育種者關(guān)注，然而調(diào)控淺蘆花羽色性狀的基因一直尚未確定。

膜相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白SLC45A2（Solute Carrier Family 45 Member 2）是SLC45A（Solute Carrier Family 45）游離載體家族成員之一[1]，是一種調(diào)節(jié)黑色素合成的轉(zhuǎn)運蛋白，在黑色素生成中發(fā)揮重要作用[2]。SLC45A2基因的突變影響酪氨酸酶的加工，導(dǎo)致人類的眼、皮膚白化病[3-4]。SLC45A2 基因的突變在狗[5]、馬[6]、鵪鶉[7]、雞[2]、鼠[8]等動物中也會引起色素沉著的變化。目前，對于淺蘆花羽性狀的研究還比較少，從遺傳角度揭示該性狀的遺傳規(guī)律和調(diào)控機(jī)制，對于家禽育種工作具有十分重要的意義。本實驗旨在通過研究SLC45A2 在“豫粉1 號”蛋雞H 系不同部位毛囊中的表達(dá)量以及在黑色素細(xì)胞中添加不同濃度的酪氨酸對SLC45A2 表達(dá)量的影響，并對SLC45A2 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為“豫粉1 號”H系淺蘆花羽色性狀的分子遺傳學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 隨機(jī)選取發(fā)育140 d 的成年“豫粉1 號”H系母雞（由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞站提供）6 只，實驗組為頸部背側(cè)組（頸背側(cè)具有黑白相間的蘆花色羽毛），對照組為頸部腹側(cè)組（頸腹側(cè)白色羽毛）。人工將雞頸部背側(cè)和腹側(cè)羽毛進(jìn)行拔毛，強(qiáng)制換羽，到10 d 待其長出新的羽毛后進(jìn)行樣品采集，用尖頭手術(shù)眼科鑷子輕輕提起羽毛，剪刀連其周圍的皮膚剪掉（注意要保留完整毛囊，周圍皮膚和皮下組織盡量少取），放入裝有RNA 保存液的1.5 mL 去RNA 酶離心管中，而后迅速放入液氮中冷凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗儀器及試劑 紫外分光光度計（NanoDro）、凝膠成像儀 SYNGENE GBOX（美國），熒光定量儀（羅氏）、臺式高速冷凍離心機(jī)Neofuge 23R（臺灣力康）、Trizol（TaKaRa 公司）、氯仿、異戊醇、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris-Cl）、2×Taq PCR Master Mix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）、滅菌的超純水、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimerScriptTMRT reagent Kit，TaKaRa公司）、Agarose 瓊脂糖（西班牙進(jìn)口），雞黑色素細(xì)胞，Medium254（Gbico），人黑色素細(xì)胞生長添加物（HMSG，Gbico）。

1.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI 上的雞SLC45A2（NM_001083364.2）序列，使用NCBI 在線數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=9031&INPUT_SEQUENCE=NM_001083364.2&LINK_LOC=nuccore），主要參數(shù)為產(chǎn)物的大小在200 bp 左右，退火溫度55～65℃，上、下游引物大小在20 bp 左右，所設(shè)產(chǎn)物至少橫跨1 個內(nèi)含子。內(nèi)參基因β-actin 的引物序列由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心提供，引物設(shè)計完成后由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物信息

1.4 雞黑色素細(xì)胞SLC45A2 驗證 第4 代對數(shù)生長期的雞黑色素細(xì)胞，設(shè)置培養(yǎng)基分為不添加酪氨酸組和分別添加10-9、10-8、10-7、10-6mol/L 酪氨酸培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)黑色素細(xì)胞，接種于6 孔板，每組3 個重復(fù)孔，重復(fù)3 次。置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后收取細(xì)胞。

1.5 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol 的方法進(jìn)行毛囊組織和黑色素細(xì)胞RNA 的提取，利用微量紫外分光光度計測定RNA 濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA完整性檢測。質(zhì)量良好的RNA，參考TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）反應(yīng) 采用Roche LightCycler 96 實時熒光定量系統(tǒng)（羅氏，瑞士）和SYBR Green I 染料法進(jìn)行qPCR，用管家基因β-actin 作為內(nèi)參，每個樣品3 個技術(shù)重復(fù)。20 μL 反應(yīng)體系：2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA 2 μL（500ng/uL），加雙蒸水至20 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，40 個循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計分析 用2-ΔΔCt法來計算目的基因的相對表達(dá)量，采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)分別進(jìn)行獨立樣本t 檢驗，單因素方差分析；用GraphPad Prism7.0 軟件作圖。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.8 SLC45A2 基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 依據(jù)NCBI 提供的BLAST 程序查找SLC45A2 基因編碼蛋白序列；氨基酸翻譯使用SDSC Biology Workbenc；氨基酸序列的信號肽預(yù)測使用Signal P Server 4.1；跨膜域預(yù)測使用TMHMM Server v. 2.0，預(yù)測SLC45A2 基因的理化性質(zhì)和疏水性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位羽色基因SLC45A2 的表達(dá)分析 如圖1所示， SLC45A2 在頸部背側(cè)淺蘆花羽色的表達(dá)量顯著高于腹側(cè)白色的表達(dá)量。

圖1 SLC45A2 在頸部背側(cè)和腹側(cè)的相對表達(dá)量

2.2 黑色素細(xì)胞中添加不同濃度酪氨酸對SLC45A2 表達(dá)量的影響 由圖2 可知，與對照組相比，黑色素細(xì)胞中添加10-9、10-8mol/L 酪氨酸使SLC45A2 表達(dá)量顯著增高，濃度為10-8mol/L 時 SLC45A2 表達(dá)量最大。說明黑色素細(xì)胞中添加酪氨酸可以促進(jìn)SLC45A2 表達(dá)，10-8mol/L 是酪氨酸在黑色素細(xì)胞中促進(jìn)SLC45A2 表達(dá)的最大添加劑量；但超過10-8mol/L 引起SLC45A2的表達(dá)量顯著下降，與空白對照組差異不顯著。

圖2 添加不同濃度酪氨酸黑色素細(xì)胞中SLC45A2 的表達(dá)量

2.3 SLC45A2 的信號肽 由圖3 可知，C 值（原始剪切位點得分）為0.110，S 值（信號肽分?jǐn)?shù)）為0.138，Y 值（被結(jié)合的剪切位點的分?jǐn)?shù)）為0.109，不符合1個典型信號肽（S 值在切割位點之前高，而在切割位點之后降低，C、Y 值趨向于+1）的標(biāo)準(zhǔn)，暗示雞的SLC45A2 不存在信號肽。

圖3 SLC45A2 基因的信號肽

2.4 SLC45A2 基因的跨膜區(qū) 如圖4 所示，SLC45A2存在12 個跨膜區(qū)，編碼蛋白為跨膜蛋白。

圖4 SLC45A2 基因的跨膜區(qū)

2.5 SLC45A2 的疏水性 如圖5 所示，第246 位氨基酸得分最高為3.789，說明在該位點的疏水性最強(qiáng)；第478 位氨基酸得分最低為-2.856，表示該位點的親水性最弱。整條多肽鏈呈現(xiàn)為疏水性，因此可以判斷SLC45A2 基因編碼蛋白為不可溶性蛋白。

3 討 論

“豫粉1 號”蛋雞是河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2015 年培育出的新的配套系，該品種是國內(nèi)唯一的土種蛋雞羽速、羽色雙自別雌雄配套系，充分利用了矮小和淺蘆花羽基因的伴性遺傳。“豫粉1 號”蛋雞的淺蘆花羽色性狀作為品種的典型特征備受育種者關(guān)注，通過查閱資料及前人的研究結(jié)果，篩選出了控制羽色性狀的候選基因SLC45A2。

圖5 SLC45A2 基因的疏水性

本實驗發(fā)現(xiàn)SLC45A2 基因在“豫粉1 號”蛋雞H 系頸部的不同羽色的表達(dá)量存在顯著差異，說明它與“豫粉1 號”蛋雞H 系淺蘆花羽色的形成相關(guān)。Qiu 等[4]研究表明SLC45A2 的突變和白化病有關(guān)。王海東等[9]認(rèn)為，SLC45A2 在不同毛色小鼠皮膚中的表達(dá)存在差異性，以及 過 表 達(dá)SLC45A2 后MITF、TYR、TYRP1、TYRP2以及黑色素含量都發(fā)生明顯變化，表明SLC45A2 通過調(diào)節(jié)黑色素的生成進(jìn)而參與毛色的形成。Wei 等[10]研究表明，SLC45A2 在1 月齡灰、白羽朗德鵝皮膚中顯著差異表達(dá)，SLC45A2 基因在黑色素生物合成過程中發(fā)揮作用。

黑色素是影響動物羽色形成的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，黑色素受一系列相關(guān)基因的復(fù)雜調(diào)控和外在因素影響，進(jìn)而影響黑色素的沉積和分布。大量研究表明，黑色素的合成主要是酪氨酸在酪氨酸酶的作用下，經(jīng)過一系列的生物化學(xué)反應(yīng)而形成的，以不同的形式在動物體表現(xiàn)出來。本實驗結(jié)果表明黑色素細(xì)胞中添加酪氨酸后，SLC45A2表達(dá)量增加。SLC45A2 表達(dá)量在酪氨酸添加劑量為10-8mol/L 時達(dá)最高，之后隨著濃度的增加，SLC45A2的表達(dá)量反而有所降低，這說明SLC45A2 在黑色素細(xì)胞中的表達(dá)對酪氨酸存在一定的劑量依賴關(guān)系。同時也說明黑色素細(xì)胞中添加不同濃度的酪氨酸可以影響淺蘆花羽色的形成，但具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，SLC45A2 在“豫粉1 號”不同羽色中的表達(dá)存在差異，黑色素細(xì)胞中添加酪氨酸后SLC45A2 的表達(dá)量上升，表明SLC45A2 通過調(diào)節(jié)黑色素的生成進(jìn)而參與毛色的形成，為SLC45A2 參與毛色形成的分子基礎(chǔ)提供新的依據(jù)。通過生物信息學(xué)對SLC45A2 信號肽、跨膜區(qū)和疏水性等方面進(jìn)行分析，表明該基因為跨膜蛋白、不可溶性蛋白，為進(jìn)一步從蛋白水平研究其生物學(xué)功能提供參考。