膜聯(lián)蛋白A8 在小鼠早期妊娠子宮中表達研究

任 杰，崔云鳳，于浩楠，吳 浩，倪 華

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030）

胎生哺乳動物在正常生理狀態(tài)下，胚泡植入母體子宮進行下一步的發(fā)育生長，即胚胎著床。胚胎著床過程對于妊娠能否順利進行至關重要，成功的胚胎著床依賴于同步發(fā)育的子宮和胚胎之間精確的相互作用[1]。畜牧動物繁殖性能的高低是影響?zhàn)B殖行業(yè)發(fā)展的重要瓶頸，胚胎著床率低是動物繁殖力低下的主要原因之一。胚胎工程技術中，體外操作過的胚胎著床和發(fā)育到期比率更低。因此，關于胚胎著床機制的研究具有理論意義和潛在的經(jīng)濟價值。

膜聯(lián)蛋白-A8（Annexin A8，ANXA8）屬于膜聯(lián)蛋白超家族（Annexins）[2]。目前，在高等脊椎動物中發(fā)現(xiàn)至少12 種膜聯(lián)蛋白，它們可以鈣依賴性方式與陰離子磷脂結(jié)合，介導某些特定蛋白分子在膜上的定位，從而調(diào)節(jié)這些蛋白的功能[3-4]。ANXA1[5]、ANXA2[6]、ANXA4[7]被證明與人和小鼠胚胎著床相關。ANXA8 與多種癌癥發(fā)生有關，ANXA8 是口腔鱗狀細胞癌檢測的分子標記物[8]；ANXA8 是胰腺癌中過表達的4 種基因之一[9]；ANXA8 在子宮鱗狀細胞癌中顯著上調(diào)[10]；ANXA8 的表達對乳腺癌細胞的生存有顯著影響[11]。ANXA8 與小鼠視網(wǎng)膜上皮細胞的分化有關[12]。在豬子宮內(nèi)膜細胞中，ANXA8 可上調(diào)著床關鍵因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）的mRNA 表達，提示ANXA8可能通過調(diào)節(jié)LIF 影響豬的胚胎著床[13]，受實驗動物和實驗手段的限制，這部分工作是在體外培養(yǎng)細胞中進行，關于ANXA8 在小鼠和其他動物圍著床期子宮中的表達和作用機制尚無報道。由于小鼠是模式動物，具有研究胚胎著床的體內(nèi)模型和體外細胞模型，便于深入開展ANXA8 研究。本研究采用原位雜交、實時熒光定量PCR、免疫組織化學的方法，從RNA 和蛋白水平檢驗ANXA8 在小鼠早期妊娠胚胎著床中的表達，在體外培養(yǎng)的小鼠基質(zhì)細胞及誘導蛻膜中，研究ANXA8 的作用，為闡明ANXA8 在動物胚胎著床中的作用機制提供實驗依據(jù)，為研究ANXA8 在大動物胚胎著床中的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物為C57BL/6J 品系小鼠。小鼠于人工控制條件下飼養(yǎng)，室溫為19～23℃，光照周期分為光照黑暗各12 h，自由采食和飲水，定期更換墊料、添補食物和水。

1.2 實驗動物模型

1.2.1 早期妊娠 將自然發(fā)情的成年雌鼠與成年可育雄鼠按2:1 合籠。次日早晨檢查發(fā)現(xiàn)陰道栓記為妊娠第1天，分別于每天09:00 收集小鼠妊娠第1～8 天子宮。收集小鼠妊娠第2～4 天子宮時，須從輸卵管或子宮中沖出胚胎以確定妊娠。收集小鼠妊娠第5 天子宮時，尾靜脈注射1%的芝加哥藍以確定著床位點。將子宮切成適當大小，一部分組織經(jīng)液氮速凍后放入-80℃冰箱凍存。另一部分用固定液固定進行石蠟包埋處理。

1.2.2 人工誘導蛻膜化 雌鼠在假孕第4 天上午，在小鼠右側(cè)子宮靠近輸卵管的部分注射芝麻油25 μL 誘導蛻膜化，另一側(cè)不注射，作為對照。在假孕第8 天上午處死小鼠，按以上方法取子宮角。利用形態(tài)變化及稱重來分辨是否發(fā)生蛻膜化，取材方法同上。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠 ANXA8 基因片段克隆及探針的制備 根據(jù)GenBank 相關序列設計小鼠ANXA8 基因的上、下游引物（上游引物：5'-GCGGGTGAGAAGATTATGGGA-3'；下 游 引 物：5'-AAGTAGCTGTGGACGTTCCG -3'），以小鼠子宮 cDNA 為模板進行PCR 擴增，使用Magen凝膠回收試劑盒純化產(chǎn)物。將回收的產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞中，挑取單菌落進行搖菌，得到的菌液送交哈爾濱博仕生物技術有限公司進行測序，將測序結(jié)果進行BLAST 同源性比對，將測序正確的ANXA8 基因片段，利用Roche 公司的地高辛標記試劑盒進行探針標記。

1.3.2 原位雜交 將10 μm 冰凍切片放入4% 多聚甲醛（PFA，pH 9～10）中固定1 h，1% TritonX-100 溶液處理切片20 min 后室溫下預雜交15 min（5×SSC，50%甲酰胺）。棄去預雜交液，后滴加雜交液（5×SSC，50%甲酰胺，0.02% BSA，10%硫酸葡聚糖，1 mg/mL變性的地高辛標記的ANXA8 RN 探針）于55℃雜交24 h。將切片分別在含有50% 甲酰胺和5×SSC、2×SSC、0.2×SSC 的溶液中55℃搖床洗滌15、30、30 min，再將切片放入0.2×SSC 溶液中，于室溫下靜置洗滌5 min。經(jīng)緩沖液Ⅰ（100 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5）平衡5 min 后在1% Blocking solution 中封閉1 h，封閉后加堿性磷酸標記的地高辛抗體（1:5 000；Roche）4℃孵育過夜。切片洗滌后，再滴加顯色液（0.4 mmol/L 5-溴-4-氯-3- 吲哚磷酸，0.4 mmol/L 硝基四唑氮藍和2 mmol/L 左旋咪唑），避光顯色過夜，出現(xiàn)陽性信號后，停止顯色。1%甲基綠復染，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 實時熒光定量PCR 取小鼠子宮組織50～100 mg，提取組織總RNA，并將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR，ANXA8（序列號：NM-013473.4）引物序列：上游引物5'-GCGGGTGAGAAGATTATGGGA-3'，下游引物5'-AAGTAGCTGTGGACGACGTTCCG-3'，由哈爾濱博仕生物公司合成。反應體系10 μL：SYBR Premix Ex Taq（2×）5 μL，Rox ReferenceDye Ⅱ 0.2 μL，上游引物0.2 μL(10 μmol/L)，下游引物0.2 μL(10 μmol/L), RNA 4.4 μL (8.8 μmol/L)。反應條件：95℃30 s；95℃5 s、60℃30 s，40 個循環(huán)后收集熒光信號。使用 Amplied Biosystems?7500 Real-Time PCR System 操作，由儀器自動繪制熔解曲線，采用 2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.3.4 免疫組織化學 取得小鼠子宮組織，固定包埋后，切成5 μm 厚的切片。切片脫蠟至蒸餾水，0.01%檸檬酸緩沖液修復、3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化酶、10%馬血清封閉后，加入Annexin Ⅷ Rabbit polyclonal antibody（1:80，proteintech），4℃過夜。用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體（1:200，ab6721，abcam），37℃孵育90 min。DAB 顯色劑顯色，蘇木精染色液復染，脫水，封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 統(tǒng)計分析 熒光定量PCR 實驗的數(shù)據(jù)結(jié)果都通過 t 檢驗進行評估，定量結(jié)果按x±s 的形式由 Graphpad Prism 軟件進行繪圖處理，并用 2-ΔΔCt進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的培養(yǎng)和誘導蛻膜化處理 將妊娠第4 天小鼠的子宮角縱向切開，用HBSS（含P/S）（Gibco）徹底洗滌后，將子宮組織置于含有1%胰蛋白酶（Sigma）的HBSS（含P/S）中，4℃下1 h，室溫下15 min，37℃下15 min，輕輕搖動裝有小鼠子宮組織的三角瓶以移除上皮細胞，棄去含有上皮細胞的上清液后，用HBSS（含P/S）沖洗剩余的組織3 次，并在含有0.5 mg/mL 膠原酶Ⅱ（Biotopped）的HBSS（含P/S）中37℃溫育30 min，將消化的子宮劇烈搖動直至上清液混濁。然后將上清過濾后，在1 000 r/min 離心5 min。細胞沉淀用HBSS（含P/S）洗滌2 次，并重懸于由DMEM/F-12（Sigma）和10% 活性炭吸附過的胎牛血清組成的完全培養(yǎng)基中；1×106個細胞接種到35 mm 直徑培養(yǎng)盤中，培養(yǎng)30 min 后，更換培養(yǎng)基以除去游離的漂浮細胞，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)[14]。

小鼠基質(zhì)細胞長到70%～80%時開始誘導蛻膜化，更換新鮮培養(yǎng)液，加入10 nmol/L 雌激素（Sigma）和1 μmol/L 孕酮（Sigma），對照組中按體積比1:1 000加入無水乙醇。分別收集處理后24、48、72 h 的細胞及對照細胞，提取RNA。蛻膜化標志分子采用小鼠蛻膜催乳素相關蛋白（Decidual Prolactin-related Protein, Dtprp），實時熒光定量PCR 檢測DTPRP 和ANXA8 mRNA 的表達。

2 結(jié) 果

2.1 ANXA8 mRNA 在早期妊娠第1～8 天與人工蛻膜化子宮中的表達 原位雜交結(jié)果表明，ANXA8 mRNA 在小鼠早期妊娠第1～4 天子宮腔上皮和腺上皮有微弱表達（圖1-A～D）。隨著妊娠的進行，胚胎在第4 天子夜著床，并且在著床位點周圍形成初級蛻膜區(qū)。ANXA8 mRNA在第5、6 天的初級蛻膜區(qū)（圖1-E、F）表達，隨后初級蛻膜區(qū)的基質(zhì)細胞繼續(xù)增殖分化成次級蛻膜區(qū)，ANXA8 mRNA 在第7、8 天的次級蛻膜區(qū)（圖1-G、H）表達，并逐漸增強。人工蛻膜化模型中ANXA8 mRNA表達在蛻膜區(qū)（圖1-I）。

2.2 ANXA8 蛋白在早期妊娠與人工蛻膜化子宮中的表達 免疫組織化學結(jié)果顯示，早期妊娠第1～4 天的腔上皮和腺上皮有ANXA8 蛋白表達（圖2-A～D），早期妊娠第5～8 天中ANXA8 蛋白表達方式與mRNA 類似，第5、6 天初級蛻膜區(qū)（圖2-E、F）與第7、8 天的次級蛻膜區(qū)（圖2-G、H）有表達；在人工蛻膜化模型中，對照一側(cè)子宮腔上皮和腺上皮（圖2-J）檢測到ANXA8 蛋白的存在，人工蛻膜子宮的蛻膜區(qū)（圖2-I）有ANXA8 蛋白表達。

2.3 ANXA8 mRNA 在體外誘導蛻膜化小鼠子宮基質(zhì)細胞中的表達 隨著誘導時間的增加，蛻膜化標志分子DTPRP 的表達逐漸升高，并顯著高于對照組，表明誘導蛻膜化成功( 圖3-A)。隨著誘導時間的增加，ANXA8 的表達逐漸升高，并顯著高于對照組(圖3-B)。

圖1 ANXA8 在早期妊娠與人工蛻膜化子宮中的mRNA 表達

圖2 ANXA8 在小鼠早期妊娠與人工蛻膜化子宮中的蛋白表達

圖3 ANXA8 在體外誘導蛻膜化小鼠子宮基質(zhì)細胞中的mRNA 表達

3 討 論

Jiang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，ANXA8 在妊娠第11～13 天的豬子宮內(nèi)膜細胞中的表達水平較高。在培養(yǎng)的豬子宮內(nèi)膜細胞中，過表達ANXA8 會上調(diào)LIF 和表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF），促進蛋白激酶 B（Protein Kinase B，AKT）的磷酸化，活化AKT 信號通路，促進豬子宮內(nèi)膜細胞的增殖；向小鼠子宮角灌注ANXA8 的siRNA 會減少胚胎的著床數(shù)量[13]。雖然ANXA8 降低會影響小鼠胚胎著床結(jié)局，但是ANXA8在小鼠圍著床期子宮中的表達變化未知，siRNA 干涉導致胚胎的著床數(shù)量減少機制未知。基于以上體外實驗結(jié)果，本實驗檢測了ANXA8 在小鼠胚胎著床中表達與調(diào)節(jié)，結(jié)果表明，在小鼠早期妊娠第1～4 天，ANXA8 定位于子宮的腔上皮和腺上皮，LIF 主要在小鼠子宮腔上皮和腺上皮以及部分基質(zhì)細胞中表達，小鼠圍著床期子宮腔上皮和腺上皮中 ANXA8 可能作為LIF 上游調(diào)控分子，參與小鼠胚胎著床過程。本研究與豬子宮內(nèi)膜細胞中研究[13]相對一致。

本實驗還檢測到ANXA8 在小鼠妊娠第5～6 天定位于初級蛻膜區(qū)域中，第7～8 天強表達于次級蛻膜區(qū)域中；第8 天在注射芝麻油的人工誘導蛻膜化小鼠子宮中，蛻膜區(qū)也發(fā)現(xiàn)ANXA8 信號，實時熒光定量PCR也進一步驗證了以上結(jié)果。體內(nèi)實驗表明，除子宮腔上皮外，ANXA8 定位于蛻膜組織，而且隨蛻膜化的進行，ANXA8 表達增強，提示ANXA8 參與子宮基質(zhì)細胞的蛻膜化過程。鑒于小鼠子宮蛻膜中含蛻膜細胞、免疫細胞等多種細胞，為了明確ANXA8 是否參與子宮基質(zhì)細胞的蛻膜化過程，本研究體外培養(yǎng)小鼠子宮基質(zhì)細胞并誘導蛻膜化，在72 h 內(nèi)，蛻膜化標志分子DTPRP顯著上升，表明細胞的確向蛻膜細胞分化。在這個過程中，ANXA8 表達明顯升高，這說明ANXA8 在小鼠子宮基質(zhì)細胞蛻膜化中發(fā)揮作用。目前，ANXA8 在胚胎著床中的研究只有Jiang 等[13]的1 篇報道。由于豬和小鼠胚胎著床方式不同，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANXA8 在子宮腔上皮中的定位與子宮接受性建立有關，并且證明ANXA8 參與小鼠子宮基質(zhì)細胞蛻膜化過程。

蛻膜是胚胎早期發(fā)育的微環(huán)境，蛻膜化起始時類似于炎癥反應，然后轉(zhuǎn)入免疫耐受以維持蛻膜中的免疫平衡保證胚胎正常發(fā)育[14]。蛻膜化過程中，伴隨大量的免疫細胞募集，這些免疫細胞在蛻膜中分化，分泌細胞因子，維持蛻膜中獨特的免疫環(huán)境，并且促進血管發(fā)生，為胎盤發(fā)育奠定基礎。有研究表明，ANXA8 在白細胞募集中發(fā)揮作用，P- 選擇素作為白細胞受體可以在炎癥激活的血管內(nèi)皮表面募集白細胞和血小板，P- 選擇素在內(nèi)皮細胞表面被CD63 穩(wěn)定。在人臍靜脈內(nèi) 皮 細 胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECS）中，干擾ANXA8 后細胞表面的CD63 和P-選擇素的表達明顯下降，并顯示出白細胞遷移和粘附的缺陷[15]。小鼠子宮蛻膜中高表達ANXA8，ANXA8 是否參與免疫細胞的招募值得進一步研究。

有研究表明，ANXA8 參與血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEG） 促 進 的血管發(fā)生。在HUVECS 中，干擾ANXA8 表達導致內(nèi)皮細胞遷移和粘附到β1 整合素連接的細胞外基質(zhì)蛋白的能力受到損害，導致VEGF 促進的血管發(fā)生削弱。ANXA8 促進CD63 在細胞表面的呈現(xiàn)促進CD63/VEGFR2/β1 復合物的形成，進而促進內(nèi)皮細胞的遷移和粘附[16]。小鼠子宮蛻膜中表達VEGF，并且進行血管發(fā)生。本研究推測蛻膜中高表達ANXA8 可能與蛻膜中血管形成及血管重塑有關。

在Hela 細胞中，ANXA8 特異性地與晚期內(nèi)體和F-肌動蛋白（F-actin）結(jié)合。改變細胞內(nèi)ANXA8 水平并顯著影響晚期內(nèi)體的形態(tài)和細胞內(nèi)分布，進而影響晚期內(nèi)體介導的內(nèi)吞和溶酶體降解。例如，ANXA8 降低會減弱EGF 和表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）通過溶酶體的降解，導致EGF 誘導的促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）激活的延長，從而引起不平衡的信號傳導[17]。EGF 是胚胎植入過程中關鍵因子[18]，ANXA8有可能通過調(diào)節(jié)EGF 信號通路影響小鼠胚胎著床。

4 結(jié) 論

本實驗中，ANXA8 mRNA 在早期妊娠第1～4 天的腔上皮與腺上皮和部分基質(zhì)細胞中表達，在第5～8 天的蛻膜區(qū)表達并逐漸增高，在人工蛻膜化模型中人工蛻膜側(cè)高于對照側(cè)。ANXA8 蛋白的表達與ANXA8 mRNA表達類似，并且在體外培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中，隨著誘導蛻膜化天數(shù)的增加ANXA8 也呈上升趨勢，證明ANXA8 在小鼠胚胎著床和蛻膜化過程發(fā)揮重要作用。本研究首次揭示了ANXA8 在小鼠圍著床期子宮中的表達規(guī)律，證明ANXA8 在小鼠胚胎著床和蛻膜化過程發(fā)揮重要作用，為后續(xù)在家畜中的研究奠定基礎。