骨傷洗劑微生物限度檢查法適用性試驗研究

巫繁菁 韋瑋 唐林 姚金娥（通訊作者）

（廣西骨傷醫院藥劑科 廣西 南寧 530012）

我院骨洗方從上世紀80年代末沿用至今已有近三十年，方含桂枝、荊芥、紫草等七味中藥，具有祛風通絡、消炎、消腫止痛的功效，用于風濕腫痛、軟組織損傷等骨科疾病，屬外用制劑，禁內服。根據骨洗方使用特點將骨洗方經水提取而成骨傷洗劑，合約0.55g生藥材·ml-1，本文按照2015年版《中國藥典》四部的規定[1]對骨傷洗劑進行微生物限度檢查法適用性實驗研究，結果穩定可行，該方法可用于骨傷洗劑的微生物限度檢查。

1.儀器與材料

1.1 儀器

生物安全柜（HR40-ⅡA2，青島海爾特種電器）、生化培養箱（DNP-9162，上海比朗儀器）、全自動壓力滅菌器（LMQ.C-80E，山東新華醫療器械）、電熱恒溫干燥箱（FY-SY-4，吳江富宇烘箱設備）、電冰箱（LG4-688，廣州施樂華）、微波爐（EM-3011EB1，合肥三洋榮事達）、恒溫水浴箱（HH-8，常州中捷實驗）、電子天平（TP-3102，感量0.1g，賽多利斯）、渦旋振蕩器（maxi mixⅡ，Thermo Scientific）、氣浴恒溫振蕩器（ZD-85，金壇市精達）。

1.2 培養基

沙氏葡萄糖液體培養基（批號：150821）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號1709152）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號170103）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號170509），北京三藥科技開發公司提供。胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號20171212），青島海博生物技術有限公司提供。沙式葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號1064381），廣東環凱微生物科技有限公司提供。

1.3 供試品

骨傷洗劑（規格：500ml/瓶，批號：20180408，20180409，20180410，廣西骨傷醫院提供）。

1.4 菌種

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[GDMCC1.220]（中國工業微生物菌種保藏管理中心）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]（中國醫學細菌保藏管理中心）、枯草芽孢桿菌（Bacillus Sulticis）[CMCC（B）63501]（廣東環凱微生物科技有限公司），白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspeigillus niger）[CMCC（F）98003]（中國食品藥品檢定研究院）。以上菌種均為第五代。

2.方法與結果

2.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌在33℃的TSB中培養24h，白色念珠菌在25℃的SDB中培養24h，黑曲霉在25℃的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養7d，然后分別用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋成含菌數為1000～10000cfu·ml-1的菌懸液，備用。

2.2 供試液制備

取供試品，混勻，作為供試液。取供試液10ml，加入45℃的TSB至100ml，作為1:10供試液。

2.3 微生物計數法建立及回收率實驗

2.3.1 常規法 實驗組：吸取5份供試液，每份9.9ml，分別加入0.1ml實驗菌液，使含菌量為10～100cfu·ml-1，混勻后吸取1ml置平皿中，傾入TSA，每株實驗菌平行制備2個平皿，另從加入真菌的供試液吸取1mL置平皿中，傾入SDA，每株真菌平行制備2個平皿。菌液對照組：取TSB5份，每份9.9ml，分別加入0.1ml實驗菌液，搖勻后吸取1ml至平皿中，傾入TSA，每株實驗菌平行制備2個平皿，另從加入真菌的TSB吸取1ml置平皿中，傾入SDA，每株真菌平行制備2個平皿。供試品對照組：吸取4份供試液1ml至平皿，2份傾入TSA，2份傾入SDA。稀釋劑組：吸取4份TSB1mL至平皿，2份傾入TSA，2份傾入SDA。

回收率計算方法：回收率＝（實驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/（菌液組平均菌落數-稀釋劑組平均菌落數）

2.3.2 稀釋法（1:10） 實驗組：取供試液（1:10）進行實驗，其余操作同常規法。菌液對照組：操作同常規法。供試品對照組：取供試液（1:10）進行實驗，其余操作同常規法。稀釋劑組：同常規法。

回收率計算方法：同常規法。

2.3.3 微生物計數法及回收實驗結果 由微生物計數法及回收率實驗結果可知，需氧菌總數、霉菌和酵母菌的總數測定采用常規法不可行，而采用稀釋法回收率均在0.5～2之間，表明稀釋法可行，見表1、表2。

表1 霉菌及酵母菌的回收實驗比值測定結果

表2 需氧菌的回收實驗比值測定結果

2.3.4 稀釋法方法驗證實驗 取供試品按照稀釋法（1:10）對需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的計數方法進行驗證，3次驗證實驗結果表明，以稀釋法（1:10）進行骨傷洗劑需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數測定，回收率比值均在0.5～2之間，說明供試品無抑菌活性，符合2015年版《中國藥典》四部1105非無菌產品微生物限度檢查的規定，見表3。

表3 稀釋法驗證實驗結果

2.4 控制菌檢查法適用性實驗

2.4.1 菌懸液制備 取2.1項下含菌量為1000～10000 cfu·ml-1的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌懸液，用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋至含菌數為 10～100 cfu·ml-1的菌懸液，備用。

2.4.2 金黃色葡萄球菌 供試品組：取1:10供試液10ml接種至100ml TSB中，33℃培養24h。陽性對照組：取含菌量為10～100cfu·ml-1的菌液1ml加入100ml TSB中，于33℃培養24h。陰性對照組：取稀釋液10ml加入100ml TSB中，于33℃培養24h。取上述培養物分別劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板，33℃培養24～48h。

2.4.3 銅綠假單胞菌 供試品組：取1:10供試液10ml接種至100ml TSB中，33℃培養24h。陽性對照組：取含菌量為10～100cfu·ml-1的菌液1ml加入100ml TSB中，于33℃培養24h。陰性對照組：取稀釋液10ml加入100ml TSB中，于33℃培養24h。取上述培養物分別劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板，33℃培養24～48h。

2.4.4 控制菌檢查驗證結果 控制菌檢查驗證結果見表4。

表4 控制菌檢查方法的適用性實驗結果

2.5 三批骨傷洗劑的微生物限度檢查

根據上述建立的微生物限度檢查法，對三批骨傷洗劑進行驗證檢查，結果均符合《中國藥典》規定，結果見表。

表5 三批骨傷洗劑的微生物限度檢查結果

3.討論

骨傷洗劑藥物組成中含有揮發性成分的桂枝、荊芥，紫草以及少量的聚山梨酯80和苯甲酸鈉，這些成分對金黃色葡萄球菌等有一定的抑制作用[2-6]，常規法實驗結果表明骨傷洗劑對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及枯草麥芽桿菌有一定的抑制作用，所以選擇采用稀釋法（1:10）來降低和消除減弱骨傷洗劑中的抑菌物質對氧菌、霉菌和酵母菌的抑菌作用，微生物計數法三次驗證實驗回收值均在0.5～2之間，說明方法可行，可用于骨傷洗劑的微生物限度檢查。