多囊卵巢綜合征卵巢顆粒細胞凋亡調控蛋白Bcl-2、Bax、p53的表達及其意義

吳堅?鄭賡唐?張琳?唐忠慶?王嵐?蘇勝紅?陳昶

【摘要】 目的 探討多囊卵巢綜合征（PCOS） 卵巢顆粒細胞凋亡基因Bcl-2、Bax、p53的表達及意義。方法 選擇35例行腹腔鏡下雙側卵巢打孔術的PCOS患者（PCOS組），另選擇同期30例行腹腔鏡婦科手術的非PCOS患者（對照組），收集術中取得的卵巢組織，通過免疫組織化學染色法檢測2組卵巢顆粒細胞凋亡調控蛋白Bcl-2、Bax、p53分布與表達，計算組織學積分，比較PCOS患者術前及術后的卵泡刺激素、黃體生成素（LH）、雌二醇、睪酮水平，PCOS組患者術后規律服用二甲雙胍1 500 mg/d，對其進行為期1年的隨訪，對比Bax陽性與Bax陰性患者的1年臨床妊娠率差異。結果 PCOS組患者的術后LH、睪酮均低于術前（P均< 0.05）。PCOS組的Bax陽性顆粒細胞主要見于囊性卵泡壁，對照組Bax陽性顆粒細胞較少，散在分布于卵巢上皮間質。2組的Bcl-2陽性顆粒細胞數量均較少。PCOS組的p53陽性細胞主要散在分布于小卵泡壁，對照組的p53陽性細胞多為散在分布。PCOS組的Bax及p53蛋白的組織學積分均高于對照組（P均< 0.05），2組Bcl-2蛋白的組織學積分比較差異無統計學意義（P > 0.05）。35例PCOS患者中，Bax陽性28例、陰性7例，術后隨訪1年，Bax陽性者的1年臨床妊娠率高于Bax陰性者（P < 0.05）。結論 凋亡調控蛋白Bax、p53可能參與PCOS患者卵巢顆粒細胞的凋亡。

【關鍵詞】 細胞凋亡;多囊卵巢綜合征;腹腔鏡手術;妊娠

Expression and significance of apoptosis regulatory proteins Bcl-2， Bax and p53 in ovarian granulosa cells of patients with polycystic ovary syndrome Wu Jian， Zheng Baotang， Zhang Lin， Tang Zhongqing， Wang Lan， Su Shenghong， Chen Yan. Department of Gynecology， Wuzhou Workers’ Hospital， the Seventh Affili-ated Hospital of Guangxi Medical University，Wuzhou 543001， China

Corresponding author， Wu Jian， E-mail： wjnzc0625@ 126. com

【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of apoptosis regulatory proteins Bcl-2， Bax and p53 in the ovarian granulosa cells of women with polycystic ovary syndrome （PCOS）. ?Methods Thirty-five PCOS patients undergoing laparoscopic bilateral ovarian drilling （PCOS group） and 30 non-PCOS patients who underwent laparoscopic gynecologic surgery （control group） were recruited in this investigation. Ovarian tissues were collected during the operation. The distribution pattern and expression level of apoptosis regulatory proteins Bcl-2， Bax and p53 in the ovarian granulosa cells were detected by immunohistochemical staining in two groups， and the histological grading scores were calculated. The levels of follicle stimulating hormone， luteinizing hormone （LH）， estradiol and tesosterone of PCOS patients were quantitatively measured and compared before and after operation. Patients in the PCOS group were given with metformin at a dose of 1 500 mg/d postoperatively and followed up for 1 year. The 1-year clinical pregnancy rate was statistically compared between patients with positive and negative Bax. Results The postoperative LH and testosterone levels in the PCOS group were significantly lower than those before operation （both P < 0.05）. In the PCOS group， the Bax-positive granulosa cells were mainly distributed in the cystic follicular wall， whereas the quantity of Bax-positive granulosa cells was small and scattered in the ovarian epithelial stroma in the control group. The number of granulosa cells with positive Bcl-2 was small in both groups. In the PCOS group， p53-positive granulosa cells were mainly scattered in the wall of small follicles， whereas those in the control group were scattered. The histological grading scores of Bax and p53 proteins in the PCOS group were significantly higher than those in the control group （both P < 0.05）， whereas the histological score of Bcl-2 protein did not significantly differ between two groups （P > 0.05）. Among 35 PCOS patients， Bax was positive in 28 cases and negative in 7 cases. During 1-year follow-up， the 1-year clinical pregnancy rate of Bax-positive patients was significantly higher compared with that of those with negative Bax （P < 0.05）. ?Conclusion Bax is probably involved in the apoptosis of ovarian granulosa cells in PCOS patients.

【Key words】 Cell apoptosis;Polycystic ovary syndrome;Laparoscopic surgery;Pregnancy

多囊卵巢綜合征（PCOS）是以稀發排卵或無排卵、高雄激素或胰島素抵抗、多囊卵巢為特征的內分泌紊亂癥候群，臨床表現包括月經稀發或閉經、慢性無排卵、不孕、多毛及痤瘡等[1]。PCOS患者因持續無排卵，嚴重情況下會使子宮內膜過度增生，增加罹患子宮內膜癌的風險[2]。在女性卵巢中，每個月有多個卵泡發育，但僅有1個優勢卵泡，其余卵泡閉鎖，這是通過顆粒細胞凋亡機制實現[3]。Das等[4]報道，PCOS患者卵巢顆粒細胞可能存在不正常的細胞凋亡調控而引起PCOS。Bcl-2 可阻止凋亡形成因子如細胞色素C等從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用。Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C的釋放，具有促凋亡作用。p53可以上調Bax的表達水平，以及下調Bcl-2的表達共同完成促進細胞凋亡作用。腹腔鏡下雙側卵巢打孔術主要用于對氯米芬抵抗PCOS患者的治療，二甲雙胍可降低雄激素水平，利于卵泡發育[5]。本研究收集對氯米芬抵抗PCOS患者卵巢打孔術取得的卵巢組織，檢測顆粒細胞的凋亡調控蛋白Bcl-2、Bax、p53分布與表達，并與非PCOS患者的卵巢組織作對比，對PCOS者予二甲雙胍治療，隨訪觀察Bax陽性者與陰性者的1年臨床妊娠率，分析PCOS卵巢顆粒細胞凋亡調控蛋白Bcl-2、Bax、p53的表達及其意義。

對象與方法

一、研究對象

收集2009至2016年在我院行腹腔鏡下卵巢打孔術的35例PCOS患者作為PCOS組，患者年齡22 ～ 38歲、中位年齡26歲，不孕年限1 ～ 4年、中位不孕年限2年，原發性不孕26例、繼發性不孕9例。35例PCOS患者均符合2003年鹿特丹會議PCOS診斷標準，患者丈夫行精液常規檢查未見異常，術前經子宮輸卵管造影術排除輸卵管阻塞，經氟米芬促排卵治療3 ～ 6個療程及螺內酯降雄激素治療均未妊娠。另收集同期在我院因良性卵巢囊腫或子宮肌瘤行腹腔鏡下卵巢囊腫或肌瘤剝離術的30例非PCOS患者作為對照組，患者年齡25 ～ 39歲、中位年齡28歲，術前3個月內未使用任何激素類藥物，并于卵泡期手術。所有病例均排除庫欣綜合征、分泌雄激素的腫瘤、先天性腎上腺皮質增生。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，入組者均簽署知情同意書。

二、方 法

1. 標本染色

收集2組患者術中取得的卵巢石蠟包埋組織塊，重新進行4 μm 厚連續切片，采用鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶連接（SP）法行免疫組織化學染色（免疫組化）。Bcl-2、Bax、p53一抗及SP免疫組化試劑盒均為丹麥Dako公司產品，購自福州邁新生物技術有限公司，按試劑盒說明書要求操作。

2. 免疫組化半定量分析

由2位副高或以上職稱病理科醫師采用雙盲法評價免疫組化結果，在電子顯微鏡400倍視野下計數切片內所有顆粒細胞和免疫組化陽性的顆粒細胞，計算同一染色強度的陽性顆粒細胞數占顆粒細胞總數的百分比（pi），并對染色強度（i）進行評分：細胞漿內無棕色顆粒出現為0分，細胞漿內有較淺的棕色顆粒出現為1分，細胞漿內有清晰棕色顆粒出現為2分，細胞漿內有明顯棕色顆粒出現為3分。組織學積分=Σpi （i+1），其中“1”為糾正系數，組織學積分最高為4，以組織學積分>3分為陽性，反之為陰性[6]。

3. 觀察內容

收集2組患者的年齡、不孕年限等一般資料，以及PCOS組術前及術后首次月經第2 ～ 5 d的卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇、睪酮等臨床資料，PCOS組患者術后規律服用二甲雙胍1 500 mg/d，對其進行為期1年的隨訪，對比Bax陽性與Bax陰性患者的1年臨床妊娠率差異。

三、統計學處理

采用SPSS 20.0 處理數據。正態分布的計量資料以表示，組內腹腔鏡術前術后比較采用配對t檢驗，組間比較采用成組t檢驗;非正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）表示，組內腹腔鏡術前術后比較采用符號秩和檢驗。計數資料以百分率表示，組間比較采用Fisher確切概率法。P < 0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、35例PCOS患者在腹腔鏡術前、術后的FSH、LH、雌二醇及睪酮比較

PCOS組患者的FSH、雌二醇在腹腔鏡術前、術后比較差異均無統計學意義（P均> 0.05），術后LH、睪酮均低于術前（P均 < 0.05）。

二、PCOS組與對照組卵巢組織切片的Bcl-2、Bax和p53免疫組化結果比較

1. 鏡下所見

PCOS組的Bax陽性顆粒細胞主要見于囊性卵泡壁，呈小片狀分布（圖1A），卵巢上皮間質也有少量散在分布。對照組Bax陽性顆粒細胞較少，散在分布于卵巢上皮間質（圖1B）。2組的Bcl-2陽性顆粒細胞數量均較少，PCOS組主要見于囊性卵泡壁（圖1C）。PCOS組的p53陽性顆粒細胞主要散在分布于小卵泡壁（圖1D），對照組的p53陽性顆粒細胞多為散在分布（圖1E）。

2. 定量分析

PCOS組的Bax及p53蛋白的組織學積分均高于對照組（P均< 0.05），2組Bcl-2蛋白的組織學積分比較差異無統計學意義（P > 0.05）。

三、PCOS患者中Bax陽性者與Bax陰性者的1年臨床妊娠率比較

35例PCOS患者中，Bax陽性28例、陰性7例。術后隨訪1年，18例（51%）成功妊娠，其中Bax陽性17例、陰性1例。Bax陽性者的1年臨床妊娠率為61%，Bax陰性者的1年臨床妊娠率為1/7。Bax陽性者的1年臨床妊娠率高于Bax陰性者（P = 0.041）。

討 論

隨著腹腔鏡微創技術的發展及普及，對于有手術指征及不愿應用促性腺激素的氯米芬抵抗PCOS患者，可行腹腔鏡下雙側卵巢打孔術。研究顯示，腹腔鏡下卵巢打孔術可改善PCOS月經周期，改善卵巢局部異常的因素，降低卵巢的張力，打開增厚的卵巢包膜，改善卵巢的微循環，從而誘導自發排卵[5]。PCOS以無排卵和高雄激素血癥為特征。一般認為，LH偏高與內分泌紊亂有關，而LH偏高可能導致卵巢功能失調，卵泡難以成熟和破裂[7]。本研究顯示，腹腔鏡雙側卵巢打孔術后PCOS患者的睪酮有所下降，提示患者的高雄激素血癥有一定程度的改善。

Dell’Aquila等[8]報道，顆粒細胞的凋亡率過高會影響卵母細胞的成熟，并起到重要的作用。有學者認為，顆粒細胞發生大量凋亡，則影響睪酮轉化雌激素，導致雄性激素升高，而在高雄激素的作用下，PCOS患者的卵泡發育出現停滯[9]。本研究通過腹腔鏡手術進行卵巢活檢，結果顯示 PCOS組Bax、p53組織學積分高于對照組，提示促凋亡蛋白Bax、p53異常升高可能促進顆粒細胞凋亡。PCOS患者的顆粒細胞凋亡與妊娠相關，顆粒細胞的凋亡率增加會導致不孕，其凋亡率高，則妊娠率低[9]。本研究中，2組卵巢組織顆粒細胞抑凋亡蛋白Bcl-2陽性顆粒細胞少而表達低，提示凋亡調控蛋白Bcl-2/Bax之間失衡對顆粒細胞凋亡有影響[8]。二甲雙胍是改善PCOS胰島素抵抗的常用藥物[10]。動物實驗顯示，二甲雙胍通過增加PCOS大鼠卵巢顆粒細胞 中Bcl-2的表達及下調Bax的表達，抑制顆粒細胞凋亡，從而促進PCOS大鼠的排卵[11]。本研究對PCOS組35例患者經腹腔鏡手術治療后予口服二甲雙胍治療，1年內有16例患者自然妊娠，1年臨床妊娠率為61%，其中Bax陽性者的1年臨床妊娠率高于Bax陰性者。限于本研究中p53陽性者例數較少，無法分析p53陽性對臨床妊娠率的影響，這有待日后加大樣本量完善研究結果。

綜上所述，凋亡調控蛋白Bax、p53可能參與PCOS患者卵巢顆粒細胞的凋亡。腹腔鏡下雙側卵巢打孔術治療PCOS可有效降低患者體內雄激素及LH水平，術后卵巢組織活檢若顆粒細胞的凋亡調控蛋白染色明顯異常，需加強藥物治療，以提高PCOS患者的妊娠成功率。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2018-08-29）

（本文編輯：林燕薇）