山藥腐爛微生物的分離、鑒定及抑制研究

劉少軍　孫亞玲　姚甜甜　舒銳　岳林旭　臧傳江　許念芳　李曉龍　焦健　彭勇

摘要：為研究山藥儲藏過程中腐爛問題，以4個山藥品種為試材，分離出采后山藥腐爛病原微生物，通過形態學、18S rRNA序列測序和構建系統進化樹的方法對分離菌株進行生物學鑒定。結果表明，引起山藥腐爛的微生物與青霉菌家族Penicillium， sclerotigenum親緣關系最近，確定該菌株為Peizicillium，sclerotigenum。利用不同pH值（3、5、7、9、11）和不同生防劑（EM原液、多粘芽孢桿菌、哈茨木霉菌、枯草芽孢桿菌、細黃鏈霉菌）對山藥青霉菌生長特性進行研究，結果表明，青霉菌生長最適pH 5—7，培養42 h最適pH 5;枯草芽孢桿菌和細黃鏈霉菌對山藥腐爛微生物青霉菌有較好的抑菌效果。

關鍵詞：山藥;貯藏型蔬菜;病原微生物;生物學鑒定;生防劑

中圖分類號：S632.1

文獻標志碼：A

論文編號：cjas18100004

0 引言

山藥是一種藥食兼用的薯蕷科薯蕷屬一年生或多年生藤本植物，深受大家喜愛，己成為農民創收的重要經濟作物。山藥為一年只收獲一季（11-12月）的蔬菜作物。為滿足市場對鮮山藥的需求，山藥采收后需進行貯藏保鮮，避免腐爛，山藥的適宜貯藏溫度為1℃—4℃，相對濕度維持在80%—85%為宜。應注意貯藏環境濕度過高過低，以免發生腐爛。引起山藥腐爛的主要病害有真菌群（鏈格孢屬、葡萄孢屬、鐮刀菌屬和青霉屬）所致的干腐病、青霉病和黑斑病所致的軟腐病。王慶美等調查了山東省山藥總種植面積約1.3萬hm2，據最新調查顯示，山藥在山東地區種植面積達到2.3萬hm2以上，每年因儲存不當損失嚴重，損失數量占總產量的10%—20%。即便是用冷庫儲藏，且傷口處蘸有純石灰粉，達到很高的儲藏標準，仍有2—3cm的長度不能食用。山藥屬于耐貯藏型蔬菜，有較耐低溫的特點，具有生理休眠期，因此，如何延長其休眠期是山藥貯藏的關鍵。薛婧等以產自河北省蠡縣的紫藥為試材，研究了山藥采后在不同溫度下的貯藏效果，結果表明，在4℃下可貯藏150天，失重率僅為4.4%，腐爛率僅為2.1%。姚甜甜等在研究不同藥劑處理對山藥種莖的貯藏效果時發現，25%咪鮮胺乳油和30%乙蒜素乳油處理過的山藥種莖腐爛霉變率為0，沒有腐爛現象，效果最好。姜瑜倩等研究表明殼聚糖、l一甲基環丙烯和特克多對山藥保鮮也有較好的效果。然而，對于微生物防腐劑在山藥上的應用研究較少。

為探究一項簡單有效的方法阻止山藥腐爛，延長山藥儲藏時間，本研究以收集到河南省和河北省的4個山藥品種（大長和芋、水山藥、鐵棍、長山細毛）為試材，分離引起山藥腐爛的病原微生物，分析其生長的最適條件，并利用不同生防劑對該微生物進行抑制研究，以期找到能夠對山藥腐爛微生物起抑制作用的微生物防腐劑，從而替代或減少化學防腐劑的用量，為新型微生物防腐劑的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

將大長和芋、水山藥、鐵棍、長山細毛4個山藥品種無菌下折斷，使兩端帶傷口，密封包裝，于25℃培養箱中培養，直至山藥傷口處長出病原微生物后進行分離、鑒定。

1.2 試驗儀器、試劑

超凈工作臺（SJ-CJ-1D，蘇州蘇潔凈化設備有限公司），恒溫振蕩培養箱（ZQTY-70F，上海知楚儀器有限公司），電子天平（AL204，梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司），恒溫培養箱（HWS-500，寧波江南儀器廠），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50S，上海博迅實業有限公司），離心機，DNA電泳槽（DYCP-31DN，北京六一儀器廠），掃描電子顯微鏡（JSM-6610LV，日本電子株式會社）。DNA提取所用的Rnase購置Sigma公司，其他化學試劑均為國產化學純，PDA培養基配方參照文獻。

1.3 供試殺菌劑

哈茨木霉菌（可溶性粉劑，有效活菌數含量≥5億/，山東綠隴生物技術有限公司），多粘芽孢桿菌（可溶性粉劑，有效活菌數100億cfu/g，山東綠隴生物技術有限公司），細黃鏈霉菌（可溶性粉劑，有效活菌數≥20億/，山東綠隴生物技術有限公司），枯草芽孢桿菌（可溶性粉劑，有效活菌數含量≥200億/g，山東綠隴生物技術有限公司），EM原液（有效活菌數≥20億/mL，山東綠隴生物技術有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 山藥腐爛微生物的分離篩選采用稀釋分離法，取腐爛長菌的山藥，用鑷子夾一小塊于150 mL PDA液體培養基的錐形瓶中，在28℃、180r/min條件下振蕩培養48h，取lmL溶液至無菌試管內，加入9mL無菌水，搖勻靜置，依次進行稀釋，獲得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀釋液，分別吸取10-5、10-6和10-7的100μL樣液至PDA平板上，用無菌涂布器涂勻，放置1h后將培養皿倒置于28℃培養箱中培養。2天后根據菌落形態挑選單菌落，分別接種到PDA平板上，培養48 h后用于后續試驗。經純化的菌株于4℃保存。

1.4.2 形態學和分子生物學鑒定鐵棍和水山藥2個品種分離后的微生物菌落，取1 mmXl mm小塊放入小玻璃瓶，用磷酸緩沖液沖洗后，加入2.5%（v/v）戊二醛和1%鋨酸固定，45%—100%酒精梯度脫水后，臨界點干燥，離子濺射金后，掃描電鏡觀察。

將純化的菌株接種于30 mL無菌的PDA液體培養基中，置于30℃培養48 h，采用SDS法提取其基因組DNA， 利 用 16S 上 游 引 物 27f（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）、下游引物1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT），18S上游引物ITSl（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）、下游引物ITS4（5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'），PCR擴增其16S rRNA和18S rRNA片段。PCR擴增體系（30μL）：模板lμL，dNTP 2μL，引物各lμL，Buffer 3μL，ddH2017.8μL，Taq酶0.2μL。PCR擴增程序為：95℃5 min;95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，循環35次;72℃10 min，4℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，膠回收后送北京六合華大基因科技股份有限公司完成測序。測序結果與NCBI數據庫中己知序列進行相似性比對;采用基因序列分析軟件DNAMAN和構建系統發育樹軟件MEGA5.22，與GenBank數據庫中相關屬種基因序列進行系統發育分析。

1.4.3 不同pH對山藥微生物生長狀況的影響得到的微生物單菌落于28℃培養箱內培養，觀察菌落生長狀況。應用菌體濕重法測定pH值對山藥青霉菌的影響。分別用0.01 mol/L醋酸和0.01 mol/L氫氧化鈣配制pH 3、5、7、9、11的溶液，取20μL過夜培養的山藥青霉菌，轉至不同pH值的溶液中，每隔一段時間稱取l mL菌液于離心管中，測定菌液質量。

1.4.4 不同殺菌劑對山藥微生物的抑制效果參考多粘芽孢桿菌、細黃鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌、EM菌5種常見生物殺菌劑的最佳劑量，取相應量至50℃左右PDA培養基中，混勻至終濃度為多粘芽孢桿菌1∶100，細黃鏈霉菌1：80，枯草芽孢桿菌1：800，哈茨木霉菌80 g/L，EM原液1：400的含殺菌劑的固體培養基，以不加殺菌劑的PDA培養基為對照。用滅菌的鑷子將培養2天的山藥青霉菌菌餅（直徑6 mm）接種于上述固體培養基上，在28C、80%相對濕度條件下培養66 h后，測量菌落直徑。并計算抑制率，如式（1）。

抑制率：對照菌直徑-處理菌落直徑X100%

對照菌落直徑

……………（1）

1.5 數據分析

結果以平均值士標準差表示，采用IBM SPSSStatistics 20統計軟件進行數據分析，Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 山藥腐爛微生物的分離與鑒定

2.1.1 不同山藥品種傷口處微生物生長情況及形態學鑒定4個山藥品種被腐爛病原微生物感染情況如圖1所示。雖然生長菌落大小不一，但外觀基本一致，經分離篩選后，發現采后山藥所生長的病原微生物表觀菌落形態基本一致，可能是同一種微生物，因此，后續試驗只選擇了鐵棍山藥和水山藥2個品種的微生物進行了掃描電鏡和分子生物學鑒定。經掃描電鏡檢測（圖1），發現2種山藥的微生物有相同的形態特征，因此，確定為同一種微生物。

2.1.2 山藥微生物的分子生物學鑒定以水山藥和鐵棍山藥2個基因組DNA為模板，分別以16S引物和18S引物進行PCR擴增。結果（圖2）發現，16S擴增無帶，18S擴增條帶正常，且18S擴增條帶顯示水山藥和鐵棍山藥菌株的18S rRNA基因序列長度分別為566、580 bp，因此，按照18S引物進行后續試驗。

將18S引物擴增后的產物進行純化、測序，序列通過NCBI比對后，選取相似序列構建系統發育樹。結果表明，水山藥（圖3）和鐵棍山藥（圖4）的微生物均與Penicillium， sclerotigenum， strain NRRL 3461在同一分支上，遺傳進化距離最近，因此，水山藥和鐵棍山藥上的微生物為同一種微生物。

2.2 山藥微生物的生長特性及抑制

2.2.1 微生物在室溫下的生長情況試驗表明，在低溫0—4℃下，平板放置7天微生物均不生長，可能低溫能抑制孢子的萌發，同時可延長山藥貯藏時間，這與趙丹丹等低溫處理能較好地延長青棗貯藏期的結果一致。本試驗探究了常溫下（20℃）菌落生長情況，如圖5所示，18 h菌落開始生長，42 h時生長較快，66 h生長達到高峰。

2.2.2 微生物最適生長pH值從圖6A可以看出，菌落在不同pH值中培養42 h后，以pH5時菌落質量最大，其次是pH 7，表明pH 5是山藥微生物最適宜的pH值。圖6B菌落質量增長曲線也可以看出，在6—18 h，菌落生長最快，質量增加明顯，18 h后微生物生長緩慢，至42 h基本穩定。其中，在42 h之前，菌落在pH 7時生長最快，質量最大;而42 h后，pH 5的條件下，生長量最大。表明山藥微生物生長的最適pH 5—7，前期在中性條件下生長較好，而后期在弱酸性條件下生長較好。

2.2.3 生防劑對山藥微生物的抑制效果不同生防劑（EM原液、多粘芽孢桿菌、哈茨木霉菌、枯草芽孢桿菌、細黃鏈霉菌）及對照培養42 h時，微生物菌落生長狀況如圖7所示。5種生防劑與腐爛微生物共同培養后，通過測量共培養的菌落直徑也能反映出生防劑對菌落的抑制情況（圖8A），從中可以發現，對照、EM原液、多粘芽孢桿菌和哈茨木霉菌的菌落直徑隨著時間的延長而增加，而枯草芽孢桿菌和細黃鏈霉菌的菌落直徑隨著時間的延長增加趨勢不大，殺菌效果好。從圖8B培養42h后殺菌劑對青霉菌的抑制率可以看出，細黃鏈霉菌對青霉菌具有較強的抑制效果，枯草芽孢桿菌的抑菌效果次之，EM原液的抑菌效果最差，抑菌效果依次為細黃鏈霉菌>枯草芽孢桿菌>哈茨木霉菌>多粘芽孢桿菌>EM原液，與菌落直徑測出的結果一致。因此，為防治山藥貯藏期間發生腐爛，可采用細黃鏈霉菌、枯草芽孢桿菌對山藥進行處理。

3 結論與討論

病原微生物在山藥儲藏過程中造成的損失最大，病害造成山藥產量降低，品質下降，山藥苗期或儲藏期易感染病害。引起山藥病害的病原微生物有很多種，其中真菌性病害報道的較多。山藥塊莖外圍有保護的皮層，此時病原微生物不易穿透，然而，在除草、收割和采后處理過程中，嚙齒動物、線蟲和人類很容易傷害山藥塊莖，病原微生物從傷口處滲透到山藥內部。本研究以河南省和河北省的4個采后山藥品種（大長和芋、水山藥、鐵棍、長山細毛）為試材，分離出引起山藥腐爛的病原微生物為真菌類微生物，這與陳蓮研究的青棗腐敗變質的主要病原菌是真菌類微生物結果一致。山藥腐爛微生物的分離與鑒定的研究也有報道，檢測了5個山藥品種的微生物，引起山藥腐爛的病原微生物有5個真菌物種（其中包括青霉菌）和4個細菌物種。本研究通過形態學、18S rRNA序列測序和構建系統進化樹的方法對分離菌株進行了生物學鑒定，結果表明，引起山藥腐爛的微生物與青霉菌家族P.sclerotigenum，親緣關系最近，確定該菌株為P.sclerotigeizum。利用不同pH值（3、5、7、9、11）對青霉菌生長特性進行研究，結果表明，青霉菌生長最適值為pH 5—7，培養42 h的最適值為pH 5;利用不同生防劑（EM原液、多粘芽孢桿菌、哈茨木霉菌、枯草芽孢桿菌、細黃鏈霉菌）對青霉菌進行抑制研究，發現枯草芽孢桿菌和細黃鏈霉菌對山藥青霉菌有較好的抑菌效果。筆者篩選出2種對青霉菌有抑制作用的微生物生防劑劑，對生防劑在山藥上的應用效果需進一步研究，以減少山藥在貯藏過程中的腐爛量，為新型微生物防腐劑的開發提供理論基礎。