ADRB2rs1042713基因多態性對抗膽堿能藥物治療難治性哮喘患兒療效的影響

任丹陽 涂彩霞 李惠英 李云巍 李明 葉冬梅 沈建玲 郭品 李遠麗 徐濤 張泉

中圖分類號 Q343.1+2;R256.12 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）23-3265-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.17

摘 要 目的：研究ADRB2（rs1042713）基因多態性對抗膽堿能藥物治療難治性哮喘患兒療效的影響。方法：選取2016年11月-2019年7月昆明市兒童醫院門診就診的171例難治性哮喘患兒，統計其ADRB2（rs1042713）基因型分布及其抗膽堿能藥物臨床療效[哮喘控制測試（C-ACT）評分、第1秒用力呼氣量（FEV1）、用力肺活量（FVC）、最大呼氣流量（PEF）、最大呼氣中斷流量（MMEF）]，對不同基因型患兒使用抗膽堿能藥物治療的應答效果進行統計分析。結果：171例難治性哮喘患兒中，148例患兒給予抗膽堿能藥物治療，其中71例ADRB2（rs1042713） AA基因型患兒中50例有應答，77例ADRB2（rs1042713） GA基因型中36例有應答。統計結果分析表明，71例AA基因型患兒使用抗膽堿能藥物治療后C-ACT評分、FEV1、FVC、PEF、MMEF改善較大，與GA基因型患兒比較差異有統計學意義（P<0.05）;AA基因型對抗膽堿能藥物的應答率是GA基因型的2.71倍[OR=2.71，95%CI（1.38，5.34），P=0.005]。結論：ADRB2（rs1042713）基因多態性檢測對抗膽堿能藥物治療難治性哮喘具有一定指導意義，其中AA基因型的應答較好。

關鍵詞 難治性哮喘;ADRB2（rs1042713）;基因多態性;抗膽堿能藥物;兒童

Effects of ADRB2 （rs1042713） Gene Polymorphism on Therapeutic Efficacy of Anticholinergic Drugs in the Treatment of Refractory Asthma Pediatric Patients

REN Danyang1，TU Caixia1，LI Huiying1，LI Yunwei1，LI Ming2，YE Dongmei2，SHEN Jianling1，GUO Pin1，LI Yuanli3，XU Tao4，ZHANG Quan2（1.Dept. of Pharmacy， Children’s Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650228， China;2.Dept. of Respiration， Children’s Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650028， China;3.School of Pharmacy， Haiyuan College， Kunming Medical University， Kunming 650106， China;4.School of Pharmacy， Anhui Medical University， Hefei 230032， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of ADRB2 （rs1042713） gene polymorphism on therapeutic efficacy of anticholinergic drug in the treatment for refractory asthma pediatric patients. METHODS： 171 children with refractory asthma were selected from outpatient department of Kunming Children’s Hospital during Nov. 2016 to Jul. 2019. The distribution of ADRB2 （rs1042713） genotype， the clinical efficacy [asthma control test （C-ACT） score， FEV1， FVC， PEF， maximal mid-expiratory flow （MMEF）] of anticholinergic drug were analyzed statistically; the response of different genotypes to the use of anticholinergic drug were also analyzed statistically. RESULTS： 148 of 171 refractory asthmatics pediatric patients were administered anticholinergic drug， among them 50 of the 71 AA genotype and 36 of the 77 GA genotype responded to anticholinergic drug treatment. Statistical analysis showed that 71 children with AA refractory asthma had improved C-ACT score， FEV1， FVC， PEF and MMEF， there was statistical significance， compared with GA genotype （P<0.05）; the response rate of the AA genotype to anticholinergic drugs was 2.71 times that of the GA genotype [OR=2.71， 95%CI （1.38， 5.34）， P=0.005]. CONCLUSIONS： The detection of ADRB2 （rs1042713） gene polymorphism has some guiding significance in the treatment of refractory asthma with anticholinergic drugs， and the response of AA genotype is better.

KEYWORDS ? Refractory asthma; ?ADRB2（rs1042713）; Gene polymorphism; Anticholinergic drug; Children

β2腎上腺素受體（β2 adrenergic receptor，ADRB2）是鳥苷酸結合蛋白偶聯受體家族的一員，廣泛存在于支氣管上皮、肺部免疫細胞中。研究發現，ADRB2基因的表達及功能可影響β受體激動劑和茶堿類藥物、抗膽堿能藥物等以ADRB2為作用靶點的支氣管擴張劑的藥物效應[1-2]。ADRB2的基因多態性與支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）易感性、哮喘惡化等相關性已被大量研究[3-10]，而與藥物治療應答相關性研究相對較少。有研究表明，與ADRB2 GG基因型相比，攜帶ADRB2 AA基因型的哮喘患兒對沙丁胺醇或沙美特羅應答較低，使用長效β2受體激動劑可增加哮喘惡化的風險[10-12]。也有研究表明，部分哮喘患者存在對β2受體激動劑應答較弱，而對抗膽堿能藥物應答較好的現象[13]。近年來，從國內有關抗膽堿能藥物治療兒童哮喘的專家共識[14-15]和臨床療效觀察評價等報道[16-18]可見，國內逐漸開始意識到抗膽堿能藥物在兒童哮喘治療中的作用，但從藥物基因組學角度，研究關于ADRB2基因多態性與抗膽堿能藥物應答的相關性報道較少。本課題組前期發現[19]，在2例難治性哮喘患兒中，ADRB2 AA基因型患兒停用β2受體激動劑，給予噻托溴銨后，患兒哮喘得到明顯控制。因此，為了驗證ADRB2 AA基因型患兒使用抗膽堿能藥物治療難治性哮喘是否應答較好，本文采用回顧性研究方法，研究了ADRB2（rs1042713）基因多態性對抗膽堿能藥物治療難治性哮喘療效的影響，以期為抗膽堿能藥物治療兒童哮喘提供參考。

1 研究對象與方法

1.1 難治性哮喘患兒納入標準和排除標準

納入標準：（1）需滿足難治性哮喘的定義：采用包括吸入性糖皮質激素（ICS）和長效β2受體激動劑兩種或更多種的控制藥物，規范治療至少6個月仍不能達到良好控制的哮喘[20]。良好控制是指不包括以下任意一項：（≥6歲兒童）日間癥狀>2次/周、夜間因咳嗽憋醒、應急緩解藥使用>2次/周、因哮喘而出現活動受限;（<6歲兒童）持續至少數分鐘的日間癥狀>1次/周、夜間因哮喘憋醒或咳嗽、應急緩解藥使用>1次/周、因哮喘而出現活動受限[21];（2）常規胸片無異常;（3）入組前有穩定的肺功能，即入組前至少2次第1秒用力呼氣量（FEV1）變異率≤5%;（4）患兒或家長簽署知情同意書，同意采集靜脈血進行ADRB2（rs1042713）基因檢測。

排除標準：（1）未按要求按時隨訪、肺功能缺失;（2）規范治療6個月內哮喘達到良好控制，或未規范治療患兒;（3）哮喘合并肺部感染或肺炎患兒。

1.2 病例來源

選取2016年11月-2019年7月昆明市兒童醫院門診收治的難治性哮喘患兒為觀察對象。根據納入標準和排除標準，共有171例患兒納入本研究，診斷均為難治性哮喘，年齡6～14歲，其中男性89例、女性82例。

1.3 治療方法

171名哮喘患兒原始治療方案均按照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[21]中規定治療方案進行治療：吸入性糖皮質激素（ICS）+長效β2受體激動劑的復合制劑[布地奈德福莫特羅粉吸入劑（瑞士AstraZenecaAB公司，進口藥品注冊標準：JX20120202，規格：布地奈德80 μg ∶ 富馬酸福莫特羅4.5 μg，用法用量：6歲及6歲以上，每次2吸，每日2次）、沙美特羅替卡松粉吸入劑（法國Glaxo Wellcome Production公司，進口藥品注冊標準：JX20150018，規格：沙美特羅50 μg ∶ 丙酸氟替卡松100 μg，用法用量：每次1吸，每日2次）]。

1.4 臨床指標

1.4.1 兒童哮喘控制測試（C-ACT）評分 對所有納入研究的難治性哮喘患兒使用抗膽堿能藥物前（現場詢問）、用藥后8周（電話回訪）進行C-ACT問卷評分[22]。C-ACT是通過回答問題方式進行打分，共包含7個問題，其中1～4題由患兒獨立完成，每個問題評分標準分為4個等級，分別為0、1、2、3分;后3題由患兒家屬完成，每個問題評分標準分為6個等級，分別為0、1、2、3、4、5分;問卷總分27分，評分越高表示哮喘控制越好，評分標準為：≤19分為未控制;20～22分為部分控制;23～27分為控制。

1.4.2 肺功能指標 對所有納入研究的難治性哮喘患兒使用抗膽堿能藥物前、用藥后8周進行肺功能檢查，肺功能指標包括FEV1、用力肺活量（FVC）、FEV1/FVC、最大呼氣流量（PEF）、最大呼氣中斷流量（MMEF）。以上述指標實測值與預測值（根據患兒年齡、體質量等計算機自動生成預測值）的比值評價患兒哮喘嚴重程度[22]，評價標準見表1。

1.4.3 抗膽堿能藥物應答 抗膽堿能藥物應答以使用抗膽堿能藥物后至少連續8周ΔFEV1≥15%[13]為標準進行評價，ΔFEV1=[（FEV1用藥后-FEV1用藥前）/FEV1用藥前]×100%。

1.5 ADRB2（rs1042713）基因分型

1.5.1 檢測方法 用熒光染色原位雜交測序的方法測定患兒白細胞中ADRB2（rs1042713）基因分型。采集患兒靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，混合均勻后，得血液樣本。取紅細胞裂解液（1×NH4Cl，北京華夏時代基因科技發展有限公司）1 000 μL置于1.5 mL EP管中，加入血液樣本200 μL，封管標記，混合均勻并靜置5 min至紅細胞充分裂解（混合液澄清透明）。將裂解好的混合液以3 500 r/min離心5 min，棄上清液，保留下層白色沉淀，用紅細胞裂解液清洗2～3次，棄上清液，根據白細胞量加入核酸純化試劑（商品名：耀金保，北京華夏時代基因科技發展有限公司）20～50 μL，混勻，靜置30 min，得待檢測混懸液。取1.8 μL待檢測混懸液，加入至ADRB2（rs1042713）測序反應通用試劑（北京華夏時代基因科技發展有限公司）管中，封管標記，放入TL998A熒光檢測儀（分子診斷儀，西安天隆科技有限公司）中相應位置。使用Microseq微測序檢測平臺程序，根據所測SNPs位點選擇62溫度通道，設置相應檢測名稱和檢測基因類型，運行檢測，檢測結束后根據ADRB2（rs1042713）位點相應質控進行基因型判讀。

1.5.2 調整方案 依據Park HW等[13]的研究，ADRB2（rs1042713）AA基因型和ADRB2（rs1042713）GA基因型患兒對β2受體激動劑的應答不佳，而ADRB2（rs1042713）GG基因型對β2受體激動劑應答較好，故ADRB2（rs1042713）GG基因型患兒不做為研究對象。所以根據ADRB2（rs1042713）基因型結果，調整ADRB2（rs1042713）AA、GA基因型患兒治療方案為：布地奈德吸入粉霧劑（芬蘭Orion Corporation Orion Pharma，Espoo Plant公司，進口藥品注冊標準：JX20050212，規格：200 μg，用法用量：6歲及6歲以上，每次1～2吸，每日1～2次）+抗膽堿能藥物{異丙托溴銨氣霧劑[上海勃林格殷格翰藥業有限公司，批準文號：國藥準字J20090031，規格：10 mL（每撳20 μg），用法用量：每日1～2撳，每日3～4次]}。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。采用吻合度檢驗考察基因型分布是否與哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律一致，吻合度檢驗是運用χ2檢驗來衡量基因型數目的觀察值（實際頻數）與該位點上全部基因型頻率分布在符合Hardy-Weinberg平衡定律時的預期值（預測頻數）之間的吻合程度。采用方差分析對治療前ADRB2（rs1042713）AA、GA基因型患兒的體質量指數（BMI）、C-ACT評分、肺功能指標進行比較;采用χ2檢驗對ADRB2（rs1042713）AA、GA基因型患兒的抗膽堿能藥物應答情況進行比較;比值比（OR）和95%置信區間（CI）表示相對危險度，采用方差分析對ADRB2（rs1042713）AA、GA基因型患兒使用抗膽堿能藥物后C-ACT評分、肺功能指標進行比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 吻合度檢驗結果

171名患兒的ADRB2（rs1042713）基因型的實際頻數與Hardy-Weinberg平衡定律下的預測頻數差異無統計學意義（P>0.05），表明本研究的基因型頻數分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，選取的樣本具有代表性。在171例患兒中，ADRB2（rs1042713）GG、AA、GA基因型患兒分別為23、71、77例，其中23例ADRB2（rs1042713）GG基因型患兒未使用抗膽堿能藥物，因此不納入統計，只有148例患兒使用抗膽堿能藥物納入統計。171例患兒ADRB2（rs1042713）基因型分布情況見表2。

2.2 148例患兒使用抗膽堿能藥物治療前BMI、C-ACT評分、肺功能指標比較

71例ADRB2（rs1042713）AA基因型患兒與77例ADRB2（rs1042713）GA基因型患兒比較，抗膽堿能藥物治療前BMI、C-ACT評分、FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF、MMEF差異無明顯變化（P>0.05）。ADRB2（rs1042713）不同基因型患兒治療前的臨床指標比較見表3。

2.3 148例患兒使用抗膽堿能藥物治療后BMI、C-ACT評分、肺功能指標比較

與77例ADRB2（rs1042713）GA基因型患兒比較，71例ADRB2（rs1042713）AA基因型患兒抗膽堿能藥物治療后C-ACT評分、FEV1、FVC、PEF、MMEF改善幅度更大，兩種基因型患兒的指標間，差異均有統計學意義（P<0.05）。且71例ADRB2（rs1042713）AA基因型患兒的臨床指標均恢復正常，提示ADRB2（rs1042713）AA基因型患兒使用抗膽堿能藥物后，哮喘控制情況優于ADRB2（rs1042713）GA基因型患兒。ADRB2（rs1042713）不同基因型患兒使用抗膽堿能藥物后臨床指標比較見表4。

2.4 148例患兒對抗膽堿能藥物應答比較

148例患兒使用抗膽堿能藥物后，71例ADRB2（rs1042713）AA基因型患兒中，50例患兒的ΔFEV1≥15%，提示有應答;77例ADRB2（rs1042713）GA基因型中，36例患兒的ΔFEV1≥15%，提示有應答。χ2檢驗結果顯示，ADRB2（rs1042713）AA基因型患兒對抗膽堿能藥物的應答率是ADRB2（rs1042713）GA基因型患兒的2.71倍[OR=2.71，95%CI（1.38，5.34），P=0.005]。ADRB2（rs1042713）不同基因型患兒使用抗膽堿能藥物的應答情況比較見表5。

3 討論

3.1 兒童哮喘用藥與ADRB2

哮喘是一種以反復發作的咳嗽、喘息、胸悶、氣促及呼吸困難為表現、兒童時期最常見的慢性氣道炎癥性疾病[21，23-24]。全國兒科哮喘協作組曾先后進行過三次全國規模的兒童哮喘流行病學調查，提示我國兒童哮喘的患病率呈顯著上升趨勢[25]。哮喘的病因及發病機制極為復雜，涉及到遺傳、特應性體質、環境、飲食、氣道高反應性、性別、肥胖、藥物等多個方面[26]。哮喘不僅影響個人的生活質量，也給家庭及社會造成了沉重的精神和經濟負擔，亦消耗著巨大的醫療衛生資源[27]。兒童哮喘具有高發病率、高復發率、高危險性的特點，作為兒童呼吸科最常見的疾病，一直以來都是兒童呼吸領域研究的熱點和難點。雖然全球哮喘防治創議（Global Initiative for Asthma，GINA）[27]中的方案得到大力普及和推廣，我國也在及時地更新《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》，但是對哮喘的病因、發病機制、診斷及治療等還存在許多盲點，抗生素的濫用和人們對激素的恐懼心理仍很嚴重，這就需要醫務工作者的進一步努力。正因如此，盡快發現新的生物學靶點及探索新的治療方法已經成為藥師和兒童呼吸科的重要關注內容。

兒童哮喘的長期治療藥物主要包括：ICS和口服糖皮質激素、長效吸入性β2受體激動劑（LABA）、白三烯受體拮抗劑（LTRA）等[21]。在臨床實踐中，在上述藥物常規治療下，部分患兒哮喘還是控制不佳，即難治性哮喘病例還是比較常見，這可能是由于存在個體差異所致，因此，進行更深入地研究和探索是十分必要的。ADRB2是鳥苷酸結合蛋白（G蛋白）偶聯受體（G Protein-Coupled Receptors，GPCRs）家族的一員，廣泛存在于支氣管上皮、細支氣管平滑肌、黏膜下腺、肺動脈內皮細胞、肺動脈平滑肌和肺泡壁中，也出現在肺部免疫細胞（如肥大細胞、巨噬細胞、嗜酸性細胞、中性粒細胞和淋巴細胞）中。ADRB2位于人染色體5q31-32，編碼413個氨基酸，在其啟動子區域單核苷酸多態性較多，除rs1042713 （A46G）外，研究較多的還有rs1042714（C79G）、rs1800888 （C491T）、Arg19Cys （T-47C）等[28]。研究發現，ADRB2（rs1042713）基因的表達及功能可影響以β2-腎上腺素受體為作用靶點的支氣管擴張劑（包括β受體激動劑、茶堿類、抗膽堿類藥物等）的藥物效應，也與哮喘、肥胖、心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病、創傷后應激障礙等的發生發展存在潛在的關系[1-2，28]。

3.2 本研究結果與其他研究結果的一致性

近年從基因角度探索基因多態性與疾病易感性、病情惡化、藥物應答的相關性已逐漸引起人們的關注，而選取的樣本具有代表性是進行基因相關研究的前提。本研究中，171例患兒ADRB2（rs1042713）基因型檢測結果為：GG基因型23例、GA基因型77例、AA基因型71例，基因型頻率GG基因型13.45%、GA基因型45.03%、AA基因型41.52%，對其進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗得χ2=0.09，P>0.05，即基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，表明本研究選取的樣本具有代表性。

兒童哮喘控制測試評分能在短期內對患兒哮喘控制狀態進行科學評估，可作為哮喘治療效果判斷的依據之一[22]。肺功能是用于評價哮喘發病及預后的重要客觀指標，哮喘患者臨床主要表現為氣道功能下降及氣流進出氣道功能受限，因此，通過測定肺功能將有助于反映哮喘患者病情進展及預后情況[29]。有研究表明，ADRB2的基因多態性與β2受體激動劑的治療應答有關，與沙美特羅+吸入性氟替卡松治療組比較，孟魯司特鈉+吸入性氟替卡松治療組的AA基因型難治性哮喘患兒的哮喘控制更佳，肺功能改善更好[11];也有研究報道，檢測ADRB2可預測抗膽堿能藥物（噻托溴銨）的應答情況，在AA基因型的21例患者中，有13例應答，應答率為61.9%，在GA和GG基因型的59例患者中，有15例應答，應答率為25.4%[13]。抗膽堿能藥物屬于支氣管舒張劑，通過與呼吸道膽堿能受體競爭性結合，阻斷乙酰膽堿的活性而舒張氣道[30]，臨床主要使用短效抗膽堿能藥物異丙托溴銨和長效抗膽堿能藥物噻托溴銨。由于有研究表明，與AA 基因型相比，攜帶GG基因型的哮喘患兒對沙丁胺醇或沙美特羅應答較好[11]，且本課題組前期也發現ADRB2（rs1042713）GG基因型患兒對β2受體激動劑應答較好，因此，本研究中23例ADRB2（rs1042713）GG基因型患兒未使用抗膽堿能藥物，均不進行使用抗膽堿能藥物后各基因型間C-ACT評分、肺功能指標、藥物應答的統計分析。ADRB2（rs1042713）AA基因型使用抗膽堿能藥物后應答率為65.7%，而ADRB2（rs1042713）GA基因型應答率為34.3%，ADRB2（rs1042713）AA基因型對藥物的應答率是ADRB2（rs1042713）GA基因型的2.71倍，表明在采用包括ICS和長效β2受體激動劑等藥物不能達到良好控制的難治性哮喘患兒中，ADRB2（rs1042713）AA基因型較ADRB2（rs1042713）GA基因型對抗膽堿能藥物的應答好。本研究對71例ADRB2（rs1042713）AA基因型和77例ADRB2（rs1042713）GA基因型患兒使用抗膽堿能藥物后C-ACT評分及肺功能指標變化情況進行統計分析，發現在用藥前ADRB2（rs1042713）AA、GA基因型患兒間各指標處于同一水平基礎上，用藥后ADRB2（rs1042713）AA基因型患兒較GA基因型患兒的C-ACT評分、FEV1、FVC、PEF、MMEF改善明顯（P<0.05），以上表明ADRB2（rs1042713）AA基因型可能對抗膽堿能藥物的應答高于GA基因型。

4 結語

與Park HW等[13]的研究一致，本研究結果表明，ADRB2（rs1042713）基因多態性與抗膽堿能藥物應答具有相關性，且AA基因型對抗膽堿能藥物的應答較好。這將為確定抗膽堿能藥物在兒童哮喘長期控制中的重要地位提供重要依據。同時也提示在患兒用藥前進行相關基因檢測，可作為藥物選擇的參考指標，從而實現抗哮喘藥物的個體化治療。

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（收稿日期：2019-07-24 修回日期：2019-10-16）

（編輯：鄒麗娟）