海南省角膜營養不良患者TGFBI基因型-表型關系的研究

唐平，王玲通訊作者，陳執，呂博琦，李蒙恩

（1. 海南醫學院第一附屬醫院眼科，海南 海口 570102；2. 海南國愛近視治療中心，海南 海口 570208）

角膜營養不良（corneal dystrophy）是一組以角膜組織出現形態、性質各異沉積物為主要病理特征，以角膜糜爛、角膜白斑、視力嚴重下降等為主要表現的遺傳性、對稱性、非炎癥性角膜疾病的總稱，不僅影響患者的生活質量、美觀，也給社會帶來沉重負擔。目前，臨床研究報道已證實，角膜營養不良與TGFBI基因突變有關[1]，本課題收集海南省各地市醫院門診及眼科收治的不同類型的角膜營養不良患者為研究對象，通過臨床、遺傳學分析及基因突變檢測等方法，在分析膜營養不良患者TGFBI基因突變特點的基礎上，研究患者TGFBI基因型-表型的關系，以期了解海南地區角膜營養不良患者TGFBI基因突變熱點，并尋找是否有新的突變位點，為角膜營養不良患者基因突變機制的研究提供參考信息。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集海南省各地市醫院門診及眼科收治的不同類型的角膜營養不良患者36例為研究組，患者均為漢族。男20例，女16例；年齡16歲-44歲，平均（31.41±3.55）歲；有明確家族史者26例，無明確家族史者10例。另選擇同期于醫院門診就診的40例排除角膜營養不良的健康者為對照組，健康者均為漢族，男28例，女12例；年齡16歲-44歲，平均（30.56±3.12）歲。予以兩組對象一般病歷資料包括性別、年齡等比較，均無統計學意義上的差異（P＞0.05），具有可比性。同時，所有研究對象均自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢查 予以兩組對象眼科詳細檢查，包括體格檢查、最佳矯正視力（BCVA）檢查、裂隙燈顯微鏡檢查、共焦顯微鏡檢查。用裂隙燈圖像采集系統記錄患者眼前節情況，測量眼壓、屈光度。

1.2.2 TGFBI基因突變分析 首先，采集兩組對象外周血標本，對白細胞基因組DNA進行提取，提取試劑盒采用威格拉斯全血基因組DNA提取試劑盒。然后，根據TGFBI基因已知突變熱點，直接選擇TGFBI基因上的第4、11、12、14外顯子予以測序。最后，測序結果陽性者予以記錄，測序結果陰性者在對剩余12個外顯子予以繼續測序。外顯子引物由上海美吉生物醫藥科技有限公司提供，引物序列及擴增條件嚴格按照引物說明書進行，純化擴增產物后行DNA雙向測序。通過對測序結果的記錄，將其與Genebank收錄的TGFBI基因予以比較，分析兩組對象TGFBI基因突變情況，并總結特點[2]。

1.3 觀察指標

1.3.1 研究組和對照組對象TGFBI基因突變情況 根據1.2.2 TGFBI基因突變檢測結果，總結并比較研究組和對照組對象TGFBI基因突變特點。

1.3.2 研究組患者TGFBI基因型-表型的關系 對研究組36例患者資料按Kannabiran分類標準進行診斷及分型，并做出遺傳學表型認定，包括Avellino角膜營養不良（ACD）型，格子狀角膜營養不良（LCD）型，Thiel.Behnke角膜營養不良（TBCD）型，Reis-Bueklers角膜營養不良（RBCD）型，顆粒狀角膜營養不良（GCD）型[3]。對比分析各種表型患者TGFBI基因突變特點。

1.4 統計學方法 統計軟件采用SPSS 20.0版本，以［n（%）］的形式對計數檢測數據進行表示，數據之間的比較用χ2對其進行檢驗，P＜0.05即提示有統計學意義上的差異。

2 結果

2.1 研究組和對照組對象TGFBI基因突變特點分析 TGFBI基因突變發生率：研究組36例患者中所有患者均發生TGFBI基因突變，TGFBI基因突變發生率為100%（36/36）；對照組40例健康者均未發生TGFBI基因突變，TGFBI基因突變發生率為0。兩組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

研究組患者TGFBI基因突變特點：（1）突變形式。研究組36例患者檢測出的TGFBI基因突變均為雜合錯義突變，突變類型共9種，包括臨床已報道的8種常規突變形式：c.370C＞T（p.R124C）、c.371G＞A（p.R124H）、c.371G＞T（p.R124L）、c.1514T＞A（p.V505D）、c.1663C＞T（p.R555W）、c.1664G＞A（p.R555Q）、c.1859C＞A（p.A620D）、c.1877A＞G（p.H626R），和新發現的突變形式：c.1694T＞A（p.L565H）。其中，c.371G＞A（p.R124H）突變形式的發生率最高，為66.67%（24/36），顯著高于其他突變形式（P＜0.05）。（2）突變位點。經檢測及統計所得，研究組36例患者TGFBI基因第4號外顯子突變頻率最高，為80.56%（29/36），顯著高于其他位點（P＜0.05）。

2.2 研究組患者TGFBI基因型-表型的關系 從表1可以看出，研究組36例患者各TGFBI基因表型對應不同的基因突變形式，存在表型異質性；ACD表型分布率最高，為66.67%（24/36）；新發現的TGFBI基因突變形式的表型為LCD。

表1 研究組患者TGFBI基因型-表型的關系分析（n=36）

3 討論

目前國內外報道與角膜營養不良（corneal dystrophy）相關的基因很多，但TGFBI基因是第一個被發現也是目前報道最為常見的相關基因[4]。在TGFBI基因突變發生率上，本研究結果顯示研究組患者為100%，對照組健康者為0，兩組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），即角膜營養不良患者均存在TGFBI基因突變。 而自1997年Munier研究報道證實TGFBI為角膜營養不良的致病基因后，關于角膜營養不良患者TGFBI基因突變形式及位點的研究不斷有新的突破[5]。而TGFBI基因突變的方式和位點是決定角膜營養不良患者沉積物具體種類、特點及對視力損傷程度的關鍵因素。因此，在已有報道的基礎上，研究角膜不良患者TGFBI基因突變新的形式仍是臨床醫學工作者探討的熱點。本研究中，研究組36例患者檢測出的TGFBI基因突變類型共9種，包括臨床已報道的8種常規突變形式和新發現的突變形式：c.1694T＞A（p.L565H）。許可等在其研究報道中，同樣發現c.1694T＞A（p.L565H）為角膜營養不良患者TGFBI基因突變新的形式，該新型突變形式的發現對拓展角膜營養不良患者TGFBI基因突變譜，開拓角膜營養不良基因病變機制研究思路具有重要的意義[6,7]。同時，本研究中c.371G＞A（p.R124H）突變形式的發生率顯著高于其他突變形式（P＜0.05），即c.371G＞A（p.R124H）為角膜營養不良患者TGFBI基因突變的主要形式，該結果與臨床研究報道一致[8]。在突變位點上，本研究結果顯示，TGFBI基因第4號外顯子突變頻率最高，為80.56%（29/36），顯著高于其他位點（P＜0.05），同樣與臨床研究報道一致[9]。

在角膜營養不良患者TGFBI基因表型上，不同表型患者角膜混濁特征相似度極高，區分難度非常大。而近年來在基因檢測技術發展進程的不斷推進下，針對臨床上難以確診表型的角膜營養不良患者可通過分子遺傳學方法予以分類診斷[10]。本研究對研究組36例患者資料按Kannabiran分類標準進行診斷及分型，并做出遺傳學表型認定，進而予以患者各TGFBI基因表型的診斷。在角膜營養不良患者TGFBI基因型-表型的關系上，本研究結果顯示，研究組患者各TGFBI基因表型對應不同的基因突變形式，提示角膜營養不良患者TGFBI基因存在表型異質性，即在不同家系中可對同一基因的不同等位基因突變體進行遺傳，最終出現不同的表型[11]。與此同時，本研究中患者ACD表型分布率最高，為66.67%（24/36），即ACD表型為角膜營養不良患者最常見的基因表型。另外，新發現的TGFBI基因突變形式的表型為LCD，可為后期TGFBI基因突變形式的研究提供新的思路[12]。

綜上，通過對海南省各地市醫院門診及眼科收治的不同類型的角膜營養不良患者TGFBI基因突變的分析，得出c.1694T＞A（p.L565H）為海南省角膜營養不良患者新發TGFBI基因突變形式，c.371G＞A（p.R124H）為主要突變形式，第4號外顯子突變頻率最高，TGFBI基因存在表型異質性。