左氧氟沙星聯合頭孢哌酮/舒巴坦對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌防耐藥突變濃度的影響＊

張欣悅，邊鋒芝，柳春梅，楊 菁，張華金，宮 英，孫成春

鮑曼不動桿菌為非發酵革蘭陰性桿菌，是醫院ICU、神經外科及呼吸科患者發生肺部感染致死的主要因素［1］。近年來，隨著各種廣譜抗生素的濫用，鮑曼不動桿菌的耐藥情況日益嚴重，使其成為醫院感染最嚴重的病原菌之一。由于碳青霉烯類藥物在治療鮑曼不動桿菌感染的出色表現，使其應用范圍和頻率加快，直接導致院內耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌 （Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）感染率呈上升趨勢。一旦感染CRAB，常發生定植感染而不易根治，給臨床治療帶來極大挑戰［2，3］。

Drlica等［4］基于對耐藥菌的深入研究，創造性地提出防突變濃度 （mutant prevention concentration，MPC）和突變選擇窗（mutant selection window，MSW）理論，成為近年來臨床有效抑制細菌耐藥及制定應對策略的參考依據和該領域的研究熱點。MPC是評價抗菌藥物防耐藥能力的新指標，特指防止耐藥突變菌株被選擇性富集擴增所需的最低抗菌濃度。MSW是指最低抑菌濃度（MIC）到MPC之間的范圍。基于該理論的闡述，當兩種或兩種以上藥物聯合應用時，細菌需要同時突變兩次或多次才能產生突變菌株。由于細菌連續突變兩次以上的概率極低，從而使MSW縮小或關閉。目前關于LVX聯合CFS對CRAB的MPC的影響研究少有報道。該研究通過體外LVX聯合CFS對CRAB的MPC影響，探討抗菌藥物聯用與MPC、MSW的規律，為臨床合理應用抗生素提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 抗菌藥物與培養基LVX注射液（0.1 g/支，批號：18052631，揚子江藥業集團有限公司）；注射用CFS（2.0 g/支，批號：16011507，深圳立健藥業有限公司）。M-H瓊脂平板培養基 （環凱微生物科技），M-H肉湯粉（英國Oxiod公司）。

1.2 菌株來源與鑒定選擇筆者所在醫院2017年1月—2017年 12月臨床標本中分離的60株CRAB。鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606購于中國食品藥品鑒定研究院；質控菌為銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922，均購自濟南奧克賽生物技術有限公司。經VITEK-2分析儀鑒定，采用紙片擴散法（Kirby-Bauer法）進行藥敏試驗，選取對亞胺培南或美羅培南耐藥的鮑曼不動桿菌60株。

1.3 實驗儀器電熱恒溫培養箱（常州杰博森儀器有限公司）；Vitek比濁儀 （法國生物梅里埃公司）；XK 96-3型微量振蕩器（江蘇大唐醫療器械有限公司）；VITEK-2全自動微生物分析儀（法國生物梅里埃公司）；DW-HL528型超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司）。

1.4 最低抑菌濃度的測定

1.4.1 單獨用藥時MIC的測定 采用微量肉湯稀釋法，測定LVX和CFS單獨應用時的MIC，并按美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2015 年標準［5］判讀結果。

1.4.2 測定LVX和CFS聯合應用時的MIC 采用簡化棋盤法［6］測定LVX和CFS聯用時的MIC。

1.4.3 FIC指數的計算及判定標準 FIC指數=MIC甲藥聯用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯用/MIC乙藥單用。 判定標準：FIC 指數≤0.5，協同作用；0.5～1，相加作用；1～2，無關作用；FIC＞2，拮抗作用。

1.5 MPC的測定

1.5.1 含單藥瓊脂平板的配制 采用瓊脂平板倍比稀釋法測定抗菌藥物分別對質控菌株和60株CRAB的MPC。LVX和CFS的藥物濃度范圍分別為0.125～512 mg/L和2～512 mg/L。每個濃度配制4個平板作為平行對照。

1.5.2 含兩藥瓊脂平板的配制 以LVX和CFS的MIC、MPC為基準，采用二倍稀釋法配制含兩藥混合的系列不同濃度梯度瓊脂平板。以LVX和CFS的單藥MIC為最低濃度，以LVX和CFS的單藥MPC為最高濃度，每個濃度4個平板。

1.5.3 菌懸液制備 從新鮮過夜培養的細菌平板上挑取單個菌落接種于20 ml MH肉湯中37℃震蕩過夜培養，3000 r/min離心后棄上清，再懸浮在200 ml MH肉湯中，震蕩培養6 h，3000 r/min離心棄上清，調整菌液濃度為3×1013CFU/L。

1.5.4 MPC的測定 取100μl 3×1013CFU/L菌液均勻涂布于含不同濃度藥物的MH平板上，每個濃度4個平板。（35±2）℃培養72 h，以4個平板均無細菌生長的最低藥物濃度為MPC。對含單藥瓊脂平板的測定為單藥MPC，對含兩藥瓊脂平板的測定即為聯合用藥后的MPC。對接近MPC篩選出來的菌株接種于無藥物的MH平皿，傳代兩次后，再接種于原篩選藥物濃度的平板上，以確定其是耐藥突變株。以上實驗重復兩次，取其平均值。計算選擇指數（selectiveity index，SI），SI=MPC/MIC。

1.6 統計學分析數據分析采用SPSS 16.0統計軟件對相關數據進行配對秩和檢驗；取P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LVX與CFS的聯用藥敏結果對60株臨床分離菌株，LVX與CFS聯用后，協同作用所占的比例為 0.50（30/60），相加所占的比例為 0.43（26/60），無關作用所占的比例為0.07（4/60），未見拮抗作用，以協同和相加作用為主。

2.2 抗菌藥物對鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606的 MIC、MPC、SI值LVX、CFS單用或聯用時對鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC19606的MIC、MPC、SI值見表1。結果顯示，LVX和CFS聯合后，MIC分別由1.0 mg/L降為0.25 mg/L、2.0 mg/L降為0.5 mg/L；MPC分別由8.0 mg/L降為 1.0 mg/L、16.0 mg/L降為2.0 mg/L，MIC與MPC都有明顯降低。LVX的MSW 由 1.0～8.0 降為 0.25～1.0；CFS 的 MSW 由2.0～16.0降為0.5～2.0，兩者的MSW明顯縮小。

表1 LVX和CFS單用及聯用對標準菌株 ATCC19606的 MIC、MPC、SI值（mg/L）

2.3 LVX和CFS對60株臨床分離菌株的MIC、MPC、SI值對60株臨床分離菌株，LVX的MIC范圍為 8～64 mg/L、MPC 范圍為 64～256 mg/L；CFS 的MIC 范圍為 8～32 mg/L、MPC 范圍為 128～256 mg/L。聯合用藥后，LVX的MIC范圍為 2～16 mg/L、MPC范圍為 8～64 mg/L；CFS 的 MIC 范圍為 4～16 mg/L、MPC范圍為64～128 mg/L，MIC與MPC都有顯著降低。聯合用藥后，LVX的MSW由8～128降為2～64；CFS的 MSW 由8～256降為 4～128，兩者的 MSW 明顯縮小；LVX、CFS單用對60株CRAB的SI分別為2～8、4～16；LVX、CFS 聯合使用 后兩 者對 60 株CRAB 的 SI分別為 2～32、4～16，與單獨用藥相比，SI值均有統計學意義（PLVX單用-聯合=0.000；PCFS單用-聯合=0.000）。結果顯示LVX聯合CFS顯著降低了MPC，縮小MSW，可以有效地防止耐藥突變菌株的產生。見表2。

表2 LVX和CFS單用及聯用對60株臨床分離菌株的MIC、MPC、SI值（mg/L）

3 討論

隨著抗生素在臨床上的廣泛應用，由耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌所引發的臨床抗感染治療失敗及院內感染的流行，對人類健康造成嚴重威脅，已成為日益嚴重的公共衛生問題［8，9］。重癥感染患者病死率相對較高，已成為臨床治療的一大難題。

該研究結果顯示，LVX與CFS聯合應用后，協同作用占50%，相加作用占43%，無關作用占7%，無拮抗作用，表明兩藥聯合可增強抑菌效果。對鮑曼不動桿菌標準菌ATCC19606和60株臨床分離菌株耐藥性研究顯示：LVX與CFS聯用后，均可降低其單用對CRAB的MPC，縮小耐藥突變選擇窗，說明聯合用藥后可以有效地防止耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌耐藥性的產生。

根據MIC理論用藥，僅可阻止大部分敏感菌的生長，臨床一般的治療方案往往使藥物濃度落入MSW內，引起耐藥突變菌富集擴增。一旦富集擴增的耐藥突變菌轉移到新宿主身上，就會成為新的優勢菌群，從而產生耐藥，導致治療失敗。MPC是一個反映抗菌藥物抗菌活性及藥物抑制耐藥突變株選擇能力的藥效學參數，與該藥物限制該種細菌耐藥突變株選擇的能力成反比例關系。Nordqvist等［7］報道了多黏菌單用及聯合利福平，可縮小其對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的MSW，防止多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥菌株出現。單藥使用欲保持血藥濃度大部分時間維持在高于MPC的水平，勢必要增加給藥劑量，同時也增加了藥品不良反應。

MSW理論為臨床合理用藥、防止耐藥菌產生提供了一種新思想，為指導臨床合理使用抗生素、有效提高臨床治愈率起到重要作用，也為控制耐藥菌在院內傳播、降低發病率和病死率發揮了積極的作用。該研究對LVX與CFS聯用后治療CRAB感染進行了初步探討，由于體內藥物濃度不斷變化，影響因素較多，如何將體外研究結果應用于體內研究尚需進一步探討。