結直腸癌患者 KRAS、NRAS、BRAF基因突變與臨床病理特征關系的研究

贠 田，王長松，李富林，呂學霞，蒙念龍，高春芳

散發性結直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率長期高居惡性腫瘤前列。結直腸癌的發生發展是多基因、多步驟的復雜過程，個體差異較大，隨著精準治療時代的來臨，基于基因檢測治療策略的選擇在提升結直腸癌的診治水平中發揮著巨大的作用，在結直腸癌靶向治療過程中檢測KRAS、NRAS、BRAF基因突變狀態對于結直腸癌的治療有很重要的意義［1，2］。結直腸癌是一個復雜的多基因參與的疾病，這些個體化藥物的靶點基因在結直腸癌中起到關鍵的作用，因此探討這些靶點與病理學因素之間的關系也很有必要。此前也有很多的文獻對這些基因進行研究，但是學者們對于這些基因與臨床病理之間的關系眾說紛紜，因此該文采用大樣本量的病例更進一步研究在結直腸癌患者中，KRAS、NRAS、BRAF 基因狀態與病理學因素之間的關系，以便能得到一個更確切的結果。

1 資料與方法

1.1 一般資料所有檢測樣本均來自2013年9月—2017年7月筆者所在醫院病理科留存蠟塊389例，均為結直腸癌病理診斷明確的腫瘤標本。其中男 225例，女 164例；年齡27～92歲，中位年齡 60歲。所有患者均經病理組織學檢查，確診為結直腸癌患者。所有患者在做KRAS、NRAS、BRAF檢測前均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑和儀器 石蠟組織樣本DNA分離試劑盒購自福建廈門艾德有限公司，KRAS、NRAS、BRAF基因突變檢測試劑盒購自廈門艾德公司。核酸蛋白質濃度測量儀B-500購自上海創萌生物科技有限公司，Mx3000P實時熒光定量PCR儀購自美國Stratagene公司。

1.2.2 DNA提取 比照蘇木精-伊紅染色在顯微鏡下標記腫瘤區域，切片過程中僅選取相關腫瘤區域，將含有腫瘤區域的DNA組織的蠟塊10μm厚連續切片5張，嚴格按照試劑盒說明步驟進行操作。DNA提取后應用核酸蛋白質濃度測量儀測量DNA質量及濃度。按照測量的DNA濃度稀釋至2～5 mg/L備用。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測 KRAS基因突變檢測試劑盒檢測KRAS基因的12、13、61密碼子上的7種突變類型。NRAS檢測外顯子2的12、13密碼子，外顯子3的59、61密碼子，外顯子4的117、146密碼子。BRAF基因突變檢測15外顯子上的V600E突變。檢測儀器使用的是美國的Agilent Mx3000P。檢測程序按照試劑盒說明書設定。

1.3 統計學分析所有數據采用SPSS 19.0統計軟件，結果運用χ2檢驗及Fisher確切概率法，檢驗水準α=0.05，并設定P值為雙側分布，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KRAS基因突變與臨床病理參數之間的相關性檢測結直腸癌中KRAS基因第12、13位密碼子7種熱點突變，總突變率為42.4%（165/389）。389例結直腸癌中，KRAS基因在直腸的突變率 （50%，120/240） 顯著高于結腸 （30.2，45/149，P＜0.05）。KRAS基因突變與性別，年齡、腫瘤分化程度，TNM分期，有無淋巴結轉移以及遠處轉移特征無明顯相關（P＞0.05）。 見表 1。

2.2 NRAS基因突變與臨床病理參數之間的相關性檢測結直腸癌中 NRAS基因第 12、13、59、61、117和146密碼子突變，總突變率為4.6%（18/389）。389例結直腸癌中，NRAS基因突變率與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度、TNM分期，有無淋巴結轉移以及有無遠處轉移其他臨床病理特征無明顯相關（P＞0.05，表1）。 NRAS基因突變的結直腸癌中未同時檢測到KRAS基因突變。

表1 389例結直腸癌患者KRAS、NRAS和BRAF基因突變分析

表2 389例結直腸癌患者KRAS、NRAS和BRAF基因突變分析

2.3 BRAF基因突變與臨床病理參數之間的相關性檢測結直腸癌中BRAF基因第600位密碼子突變 GTG→GAG （V600E），突變率為 4.1%（16/389）。389例結直腸癌患者中，BRAF基因突變與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度、TNM分期、有無淋巴結轉移以及有無遠處轉移無相關性 （P＞0.05，表1）。BRAF基因V600E突變的結直腸癌中未同時檢測到KRAS基因突變。

2.4 KRAS、NRAS和BRAF基因突變分析在389例結直腸癌患者中，KRAS基因突變率為42.4%（165/389），12、13密碼子中檢測的 7個常見突變的比 率 分 別 為 GGT→GAT （14.7% ），GGT→GTT（7.96%），GGC→GAC （7.46%），GGT→GCT（6.94），GGT→TGT （2.31%），GGT→AGT （2.06%），GGT→CGT（0.77%）。其中以 GGT→GAT突變率最高14.7%，最為常見，GGT→GTT（7.96%）次之。 NRAS總突變率為 4.6%（18/389）， 在 12、13、61、117 和146密碼子中檢測17種常見的突變，其中共有4種常見的突變，位于12、13和61密碼子上，分別為：GGT→GAT（12 號密碼子 0.8%）、GGT→GAT（13 號密碼子 0.5%）、GAA→CTA （1.8%）、GAA→AAA（1.5%）。BRAF 基因 V600E點突變率 4.1%（16/389）。 見表 2。

3 討論

結直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率呈明顯上升趨勢，逐漸成為一種嚴重危害人類健康的惡性疾病。隨著靶向治療的應用，結腸癌患者預后有了明顯改善［2，3］。 KRAS、NRAS 以及BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK通路中的重要組成部分，而該通路對于細胞增殖、分化、基因表達、有絲分裂以及細胞凋亡有重要的調控作用。

結直腸癌KRAS基因突變率為30%～60%，結直腸癌中KRAS基因突變主要集中12、13密碼子上［4］。 該實驗 KRAS基因總突變率為 42.4%（165/389），在389例結直腸癌中，KRAS基因在直腸的突變率（50%，120/240）顯著高于結腸（30.2，45/149，P＜0.05），表現在直腸中KRAS基因更易發生突變。目前的研究熱點對于右半結腸與左半結腸由于胚胎來源的差異，其分子特征、致癌基質等方面也存在相應的差異已經得到各界的認可。對于結腸和直腸由于部位、功能的差異是否也存在著基因的差異有待進一步的研究。

NRAS是RAS基因家族中的一員。NRAS基因在結直腸癌中突變率為1%～6%，NRAS突變主要位于外顯子2、3、4的多個密碼子上，這些密碼子編碼的氨基酸是RAS蛋白和GTP酶活化蛋白（GAP）的作用位點，突變可導致RAS-GTP處于持續激活狀態，引起細胞惡性增殖和轉移［5］。NRAS在結直腸癌中突變率報道并不多見，有國外的研究發現，NRAS的突變率不高，在西方人中大約為3.8%，亞洲人的突變率為 3.6%，阿拉伯人中的突變率為 4%［6，7］。 該研究發現NRAS的突變率為4.6%，與國內外的大多數研究結果相同。在NRAS的突變與臨床病理特征之間的關系方面，國外的研究并沒有發現NRAS突變與之有關的病理特征。該研究389例結直腸癌患者中，NRAS總突變率為4.6%（18/389），總體突變率不高。同時沒有發現NRAS的突變結直腸癌患者年齡，性別，腫瘤分化程度，TNM分期，有無淋巴結轉移以及遠處轉移特征明顯相關性（P＞0.05）。

BRAF基因位于7q34，長約190kb，在絕大多數組織和細胞類型中，BRAF是MEK/ERK最為關鍵的激活因子。BRAF蛋白的主要功能為有絲蛋白激酶（MAPK）通路中的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，該激酶將幫助信號從RAS轉導至MEK1/2，參與調控細胞內多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等［8］。對于BRAF基因在結直腸癌中突變率研究國內外也存在著很多不一致，在西方人群中BRAF的突變率為9.2%，亞洲人群的突變率為4.9%，中東人群的突變率為4.6%［9］。國內的研究認為，BRAF的突變率為3%～8%［10］，在BRAF基因突變主要與腫瘤直徑、患者年齡以及有無轉移有相關性。而在該研究中發現，BRAF基因與患者年齡有相關性 （P＜0.05），與患者性別，腫瘤分化程度，TNM分期，有無淋巴結轉移以及遠處轉移特征無明顯相關 （P＞0.05）。與臨床病理關系存在突變率差異的原因有多方面的，樣本量的多少會直接影響統計的結果，檢查方法的不同，也會造成結果的差異性。

綜上所述，對KRAS、NRAS及BRAF基因進行分析，KRAS的突變率明顯高于NRAS與BRAF，可見在結直腸癌中KRAS突變時常見的生物學事件，而在KRAS突變的患者中并沒有發現NRAS以及BRAF突變，可見三者的發生是屬于相互聯系的通路，一個基因發生突變將制約另外兩個基因的發生改變。KRAS、NRAS和BRAF基因檢測人群的篩選對結直腸癌患者治療方案的選擇意義重大，能夠更有效地指導精準醫學個體化治療。