高通量基因測序確診PKD1基因新移碼突變致常染色體顯性遺傳性多囊腎＊

賈玉敏，范亞平，蔣 霞，解心悅，施釗鈺，袁 莉

常染色體顯性遺傳性多囊腎（autosomal dominant polycystic kidney，ADPK）是最常見的腎臟遺傳性疾病，由兩個主要基因PKD1（80%～85%）和PKD2（15%～20%）的突變引起［1］。與 PKD2 突變型相比，PKD1突變型患者終末期腎病發生時間要早20年［2］。ADPK的外顯率近100%，患者子女的再發風險為50%，基因檢測可以早期確診，明確致病變異，可通過遺傳咨詢有針對性地指導家系管理（包括家系的臨床篩查和產前診斷）。該文報道通過新一代測序明確由PKD1基因雜合移碼變異導致的ADPK家系1例。

1 資料與方法

1.1 臨床資料先證者，男，49歲，2010年因夜尿增多就診，查肌酐156μmol/L，彩超提示多囊腎，多囊肝。2014年肌酐升至1136μmol/L開始血液透析治療，無多囊腎家族史（圖1、2）。患者女兒25歲，目前腎功能正常，B超未提示有典型PKD腎臟病變。影像學檢查：先證者2018年泌尿系統B超見右腎大小237 mm×103 mm×109 mm，左腎大小279 mm×120 mm×134 mm，雙腎布滿大小不等之液性暗區，左側最大80 mm×71 mm，右側最大60 mm×37 mm；左右腎內見數枚強光團，最大直徑5 mm；提示多囊腎，雙腎結石（圖 2）。

圖1 多囊腎病家系圖

圖2 先證者多囊腎B超圖

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本采集與DNA提取 經知情同意后，采集先證者及其女外周靜脈血各3 ml，置于ETDA抗凝管中，使用TIA Namp Blood DNA Kit（北京天根生化科技有限公司，中國）血液試劑盒從外周血淋巴細胞中提取基因組DNA。

1.2.2 Long-PCR 由于PKD1基因特殊性，可分為單拷貝區域和多拷貝區域。在多拷貝區域中，基因組序列BLAT結果顯示6個假基因序列與目標序列相似度高達98%～99%左右，尋找PKD1真基因與假基因的細微序列差異，挑選PKD1基因第1號外顯子到第34號外顯子間的差異序列進行引物設計，共設計長片段引物4對。同時，PKD1基因單拷貝區域和PKD2基因設計長片段引物6對。PCR擴增采用Applied Biosystems Veriti 96孔熱循環PCR儀，擴增產物用Agencourt AMPure XP磁珠純化后，使用Qubit 2.0分別定量，并以相等的摩爾比合并。

1.2.3 Illumina測序及生物信息學分析 將2 mg LR-PCR產物合并在200 ml Tris-EDTA緩沖液中，并使用Covaris法隨機打斷成長度為180～280 bp的片段并回收。使用Agencourt AM Pure XP磁珠對樣本進行進一步純化。構建Illumina測序文庫時將回收片段進行末端修復反應，將測序特定接頭（Adapter）同末端修復產物進行連接反應，根據Adapter上的通用引物結合位點進行產物的擴增反應，純化回收產物。帶有特異index的文庫pooling后與生物素標記的探針進行液相雜交，再使用帶鏈霉素的磁珠將基因上的外顯子捕獲下來，經PCR線性擴增后進行文庫質檢，質檢合格后用Illumina Next Seq 500測序儀進行測序。

原始圖像文件經過Illumina base calling Software 1.7進行堿基讀取，獲得讀長為90 bp雙末端序列reads。去除低質量和污染的reads，去除Adapter序列得到純化數據進行序列比對分析，用soap軟件分析拷貝數、多態性和插入/缺失，并且進行注釋篩選可疑致病突變。并經SIFT（http：//sift.jcvi.org/） 和 Polyphen 軟 件 （http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph/）等蛋白預測軟件對其進行蛋白功能預測。

1.2.4 Sanger測序驗證 根據新一代測序所得基因突變位點序列設計引物，對患者及其女目標序列進行Sanger測序，分析測序結果。采用PCR方法擴增，反應條件為：25μl的反應體系中包含10×擴增緩沖液 2.5μl，94℃預變性 5 min，94℃變性 40 s，57℃退火 40 s，72℃延伸 60 s條件循環 35次后72℃延伸10 min。見表1。

2 結果

通過對目標序列及側翼區進行詳盡分析，發現該受檢者攜帶PKD1基因c.10396_10397delTC（Ala3467Ilefs＊3）雜合移碼變異，是ADPK的致病變異。PKD1基因c.10396_10397delTC變異發生在第33號外顯子上，該變異使PKD1基因編碼區第10396至10397位的胸腺嘧啶脫氧核苷酸（T）、胞嘧啶脫氧核苷酸（C）缺失，導致其編碼的蛋白第3467位氨基酸由丙氨酸（Ala）變為異亮氨酸（Ile），并在其后第2位提前出現終止密碼子，可能導致蛋白截短表達，影響其功能。該變異未見人群頻率報道（數據來源：1000G、ExAC、esp6500 和 gnomAD），是一個罕見變異。見圖3。

表1 Sanger測序引物序列表

圖3 基因測序圖

3 討論

ADPK是由腎小管上皮細胞基因突變引起的，可導致細胞增殖和囊腫形成，并進展至慢性腎病［3］。PKD1基因導致的ADPK可于任何年齡發病，多于青中年時期被發現，以雙側多發腎囊腫為主要特點，伴隨腎功能異常、高血壓、腎痛、腎結石、尿路感染等。除腎囊腫外，患者也可出現其他器官囊腫，包括肝臟、精囊、胰腺和蛛網膜等［4］。

ADPK的臨床診斷依賴于家族史及腎臟影像學表現（如超聲、CT及MRI），然而年輕人影像學結果往往模糊不清，特別對于無家族史的患者，早期明確診斷仍有難度。該文先證者無多囊腎家族史，其女亦無異常腎臟的影像學資料提示。所以，基因檢測在ADPK患者的早期診斷中發揮著重要作用，而且隨著對ADPK潛在有效藥物治療的發展，對準確診斷基因檢測的需求也越來越迫切［5］。

在ADPK的突變分析過程中，要注意以下幾個方面：首先ADPK的突變分析被PKD1和PKD2的大尺寸和復雜的基因組結構、顯著的等位基因異質性和帶有低營養等位基因的常見錯義突變所阻礙［6］，其次要注意真假基因的篩選。PKD1基因外顯子1至33與人類基因組16號染色體區域存在六段高度相似的序列，即在離PKD1基因13到16兆堿基處存在六個與其高度同源的假基因，與真基因序列同源性為97.7%［7］。此區域結構復雜，部分區域GC含量高達70%甚至80%。而在檢測變異的PCR過程中往往同時擴增出這些同源假基因序列，導致對真突變基因的鑒定產生困難。測序前進行LR-PCR可以有效避免這些假基因的PCR產物的污染，放大PKD1基因區域，同時避免假基因序列的干擾［8］。

該文中，筆者所在課題組使用了一種新的NGS PK基因分型方法，分析靈敏度及特異性分別為99.2%，99.9%，優于單純Sanger測序方法。該方法基于PKD1和PKD2基因的LR-PCR擴增，使用10對精心設計的PCR引物覆蓋約68.0 kb的PKD基因組區域，相當于 31.9 kb（68.8%）和 35.8 kb（51.0%）的PKD1和PKD2基因［9］。鑒于NGS技術對復雜結構基因、GC含量高的區域檢測仍有欠缺之處，實驗使用新一代測序聯合Sanger驗證相互補充以確?；驒z測的準確性。

該文的先證者病史及影像學檢查支持PKD的診斷，但無家族史，其女年僅20余歲，無PKD影像學診斷依據，針對該文2例患者，筆者所在課題組使用基于NGS的基因分型方法，該方法更適合于標準的臨床診斷設置，通過對每例患者進行單獨條形碼編碼，可以實現快速周轉時間和高靈敏度。經過檢測，發現先證者及其女攜帶的PDK1基因c.10396_10397delTC（Ala3467Ilefs＊3）變異為致病變異，該突變目前尚未見報道，該次發現豐富了PKD1的突變譜，有助于開展ADPK的基因診斷，同時對于該雜合移碼變異引起疾病的進一步研究，將有助于對ADPK發病的分子學機制、基因突變類型和臨床表型關系的進一步理解。

（感謝中科基因醫學檢驗所給予的技術支持）