Cortactin在應力誘導的氣道黏液分泌過程中的介導作用①

吳海豐 李 琪 Juliy M Perelman Victor P Kolosov Andrei Shpakou 周向東

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內科,海口570102)

慢性氣道炎性疾病常伴有氣道阻塞，氣道機械作用力亦有改變，其中剪應力的改變尤為突出，異常升高的應力可誘導氣道黏液高分泌[1]。過量的黏稠液體不但影響氣道上皮纖毛的正常擺動、削弱氣道廓清能力、降低氣道防御功能，還有助于病原微生物的寄殖，使呼吸道炎癥趨于惡化。皮層肌動蛋白結合肽(Cortactin)是大多數極化上皮細胞皮層區(qū)域中的一種肌動蛋白交聯(lián)蛋白[2]，其在氣道黏液出胞分泌過程中發(fā)揮關鍵作用[3]，但目前Cortactin參與該過程的確切機制尚未明了。故本實驗以剪應力作為刺激因素，分別轉染Cortactin定點突變體，比較剪應力作用后各組細胞中不同位點p-Cortactin蛋白水平及細胞培養(yǎng)上清液中MUC5AC含量的差別，推斷出Cortactin介導MUC5AC分泌的關鍵位點，為慢性氣道炎性疾病的治療提供新的啟示。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 氣道上皮細胞Beas-2B(美國ATCC)；10%小牛血清、0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)；各型Cortactin突變體及野生型Cortactin重組真核表達載體(重醫(yī)劉春漪博士饋贈)；MUC5AC單克隆抗體(Chemico公司)；鼠抗人 Cortactin及p-Cortactin單克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體(Abcam公司)；Lipofectamine 2000轉染試劑盒、引物(上海生科公司)；剪應力裝置(重慶醫(yī)科大學生命科學院實驗室提供)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及處理 將Beas-2B細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中孵育，當細胞融合約達80%時，用PBS沖洗2遍，并予細胞分組：空白對照組：僅予等體積的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，未予其他特殊處理。SS組：僅予剪應力刺激，30 r/min，30 min。SS+野生型Cortactin組：轉染野生型Cortactin后予剪應力刺激30 min。……