理氣導滯法對慢傳輸型便秘小鼠結腸動力的促進作用

陳 霞, 溫偉波, 張 鵬

(1.云南省中醫醫院,云南 昆明650021；2.云南省第一人民醫院,云南 昆明650000)

慢傳輸型便秘是臨床常見的頑固性功能性便秘,其特征是結腸推進力減弱,內容物通過減慢,病因至今尚不清楚［1］,導致治療困難［2］。目前,由中胚層間充質細胞分化而來的Cajal 間質細胞,特別位于環行肌與縱行肌間隙中的,被證實是胃腸運動產生節律性慢波的主要起搏細胞［3］,大量研究也將其作為治療慢傳輸型便秘的靶向目標。課題組前期經過長期臨床實踐,總結出治療慢傳輸型便秘的理氣導滯法［4］,動物實驗發現該方法對腸道傳輸功能有明顯改善作用［5］；本實驗在此基礎上,探討其對慢傳輸型便秘小鼠結腸動力的促進作用。

1 材料

1.1 動物 健康成年清潔級昆明種雄性小鼠,體質量(21±2) g,由北京華埠生物科技股份有限公司提供,飼養于云南省中醫醫院中心實驗室,動物實驗設施使用許可證號SCXK(京) 2014-0004,于室溫10 ～20 ℃、相對濕度50%～70%、清潔安靜環境的條件下采用架式分籠養飼養,每天正常進食飲水。動物觀察為開放式,照明、換氣等條件控制在規定范圍內,為了減少腸易激的影響,實驗前分別進行7 d 環境適應期、5 d 生理鹽水灌胃期。

1.2 試藥 理氣導滯法組方采用四逆散加陳皮、炒厚樸、黃芪、生白術、苦杏仁、火麻仁、全瓜蔞、檳榔,藥材選用中藥免煎顆粒劑(江陰天江藥業有限公司,批號醋柴胡18072211、白 芍18082191、 炒 枳 殼18081371、 全 瓜 蔞18071411、陳 皮18061111、 炒 厚 樸18061051、 苦 杏 仁18091531、甘 草18071941、 火 麻 仁18070411、 郁 李 仁18060881、 黃 芪 18080041、 生 白 術 18091041、 檳 榔1609180),造模選用鹽酸洛哌丁胺膠囊(西安楊森制藥有限公司,批號160912319),陽性對照選用枸櫞酸莫沙比利片(江蘇豪森藥業股份有限公司,批號160904),制成相應混懸液備用。

2 方法

2.1 分組 實驗前將適應性飼養后的50 只小鼠按照隨機數字法分為正常組、模型組、陽性對照組及理氣導滯法組方高、低劑量組(根據人-小鼠等效劑量換算得出高劑量組,以及高劑量半量的低劑量組),每組10 只。各組小鼠在精神、活動、體質量、排便分布情況上無明顯差異,具有可比性。

2.2 造模 參照文獻［6］,采用阿片受體激動劑——鹽酸洛哌丁胺膠囊建立慢傳輸型便秘小鼠模型。除正常組外,其余各組小鼠灌胃給予膠囊混懸液(10 mg/kg),連續3 d,其間正常進食飲水；正常組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水,以避免干擾。

2.3 給藥 造模3 d 后,陽性組小鼠灌胃給予枸櫞酸莫沙比利(2 mg/kg),理氣導滯法組方高、低劑量組小鼠分別灌胃給予26、13 g/kg 方劑,正常組、模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水,造模、干預灌胃給藥間隔30 min,連續4 d。其間正常進食飲水,每天監測體質量、精神、活動、排便情況。

2.4 指標檢測 將小鼠放入鋪有濾紙的鼠籠內,每籠放1只,每天定時收集并記錄小鼠糞便頻次、份量、質地、首次排便時間,電子天平稱量24 h 糞便濕重,以及經電熱恒溫干燥箱干燥后的糞便干重,計算24 h 糞便干、濕重之差(24 h 糞便濕重-24 h 糞便干重) 以反映糞便含水量。

最后一次給藥后小鼠禁食禁水24 h,取0.4 mL 活性炭混懸液模擬腸內容物灌胃,90 min 后頸椎脫臼法處死,迅速剖開腹腔,取出賁門至直腸末端的腸道,幽門處離斷,觀察胃排空程度,再輕輕將腸管置于托盤中拉直,在松弛狀態下測量活性炭混懸液在腸道內推進的長度及腸道的全長,計算活性炭混懸液推進長度占腸道全長比例(炭末混懸液前端與幽門的距離/腸道總長度×100%) 以反映腸道傳輸功能。

每組隨機選擇5 只小鼠分離結腸組織,取升結腸、橫結腸、降結腸、乙狀結腸、直腸組織各約1.0 cm,光鏡下觀察全結腸改變,其中整個肌層包括平滑肌細胞、肌間叢神經節細胞等。然后,測定結腸腸肌叢Cajal 間質細胞CD117 表達、結腸Cajal 間質細胞c-kit 表達。

2.5 統計學分析 通過SPSS19.0 軟件進行處理,數據用表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用秩和檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠一般情況 各組小鼠存活率均為100%,實驗期間其進食飲水、精神活動、皮膚毛發均正常。表1 顯示,模型組、陽性對照組及理氣導滯法組方高、低劑量組小鼠體質量均顯著大于正常組(P＜0.05),并且各組間無顯著差異(P＞0.05)。

表1 理氣導滯法對小鼠體質量的影響n=10）

表1 理氣導滯法對小鼠體質量的影響n=10）

注：與正常組比較,*P＜0.05

組別 體質量/g正常組 20.91±0.64模型組 21.77±0.36*陽性對照組 21.49±0.51*理氣導滯法組方高劑量組 21.59±0.66*理氣導滯法組方低劑量組 21.74±0.56*

3.2 理氣導滯法對小鼠糞便含水量的影響 由于各組數據方差不齊,不符合正態分布,故通過K-S 秩和檢驗進行分析。結果,正常組、模型組小鼠糞便含水量無顯著差異(P＞0.05),陽性對照組、理氣導滯法組小鼠其含水量與模型組比較亦然(P＞0.05)。

3.3 理氣導滯法對小鼠胃腸動力的影響

3.3.1 胃排空 圖1 顯示,正常組、陽性對照組、理氣導滯法組方高劑量組小鼠胃排空情況很好,理氣導滯法組方低劑量組小鼠情況較好,模型組小鼠有大量潴留。

3.3.2 腸道傳輸功能 表2 顯示,模型組小鼠腸推進距離顯著短于正常組(P＜0.05),理氣導滯法組方組小鼠其距離顯著長于模型組(P＜0.01)。

圖1 各組小鼠胃排空情況

表2 理氣導滯法對小鼠腸道傳輸功能的影響（，n=10）

表2 理氣導滯法對小鼠腸道傳輸功能的影響（，n=10）

注：與正常組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 腸推進距離/cm正常組 58.18±13.02模型組 45.92±8.05*陽性對照組 59.40±13.58＃理氣導滯法組方高劑量組 59.97±8.27＃＃理氣導滯法組方低劑量組 61.80±19.24＃＃

3.4 理氣導滯對小鼠結腸黏膜影響 圖2 顯示,與正常組比較,模型組、陽性對照組小鼠結腸黏膜呈輕度慢性炎癥改變,理氣導滯法組方組小鼠結腸黏膜炎癥改變較少。

3.5 理氣導滯法對小鼠結腸腸肌叢Cajal 間質細胞CD117的影響

3.5.1 免疫組化染色 圖3 顯示,模型組小鼠結腸c-kit標記的腸肌叢Cajal 間質細胞陽性表達較正常組明顯減少,陽性對照組、理氣導滯法組方組其陽性表達與模型組相比均有所升高。

圖2 各組小鼠乙狀結腸黏膜HE 染色（×100）

圖3 各組小鼠Cajal 間質細胞免疫組化圖（模型組×100，其他組×200）

3.5.2 細胞計數 表3 顯示,模型組小鼠Cajal 間質細胞數較正常組顯著降低(P＜0.05),理氣導滯法組方高劑量組小鼠其數量與模型組比較顯著升高(P＜0.05),而低劑量組無顯著變化(P＞0.05)。

表3 理氣導滯法對小鼠Cajal 間質細胞數的影響n=5）

表3 理氣導滯法對小鼠Cajal 間質細胞數的影響n=5）

注：與正常組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 Cajal 間質細胞/個正常組 27.00±12.93模型組 17.22±6.55*陽性對照組 34.44±19.77＃＃理氣導滯法組方高劑量組 25.32±11.32＃理氣導滯法組方低劑量組 22.24±11.72

3.6 理氣導滯法對c-kit 相對表達量的影響 表4 顯示,模型組c-kit 相對表達量較正常組顯著升高(P＜0.05),理氣導滯法組方高劑量組其相對表達量與模型組比較顯著降低(P＜0.01),而低劑量組無顯著變化(P＞0.05)。

表4 理氣導滯法對c-kit 相對表達量的影響n=5）

表4 理氣導滯法對c-kit 相對表達量的影響n=5）

注：與正常組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 c-kit 相對表達量正常組 0.36±0.01模型組 1.56±0.38*陽性對照組 0.98±0.37＃理氣導滯法組方高劑量組 0.77±0.46＃＃理氣導滯法組方低劑量組 1.13±0.51

4 討論

近年來流行病學調查顯示,全球范圍便秘發病率為0.7%～79%［7］,國內為3%～17%［8］,其中慢傳輸型便秘發病率高居各種便秘亞型之首［9］,其病因復雜不清,可靠有效的治療方法仍然在探索中。中醫認為,它屬“便秘” 范疇,患者有“排便費力、便不盡感” 的特征,氣滯貫穿病程始終,治療時應從理氣導滯入手,通過調整逆亂氣機,消除腸道積滯,最終產生有效蠕動,緩解結腸動力不足。

理氣導滯法組方由調暢氣機經典方四逆散化裁而來,方中柴胡、芍藥、陳皮疏肝理氣,配伍枳實、厚樸、檳榔消積導滯,黃芪、白術健脾益氣助運,火麻仁、苦杏仁、全瓜蔞清熱潤腸,佐甘草緩急和中,全方疏肝理氣、消痞導滯、通補兼顧。現代研究發現,四逆散可明顯促進胃腸動力［10-11］,其提取物具有增強胃腸動力的作用［12］,柴胡、枳實、白術、檳榔對腸道傳輸也有明顯促進作用［13］,結合臨床療效推測理氣導滯法能提高胃腸傳輸,上調Cajal 間質細胞功能,故構建慢傳輸型便秘小鼠模型。結果顯示,理氣導滯法能改善小鼠腸道傳輸能力,以高劑量組更明顯,并且對糞便含水量未產生明顯影響,提示該方法改善了小鼠便秘情況,對慢傳輸型便秘具有良好的治療作用,而且不同于其他刺激性瀉劑,該作用不是增加糞便水分,而是促進腸道蠕動來實現。

特異性標志物酪氨酸蛋白激酶受體c-kit (又名CD117)［14］可標示產生消化道慢波電位的“起搏點” ——Cajal 間質細胞,其數量和分布不同均可導致結腸運動功能紊亂。本實驗采用免疫組化方法,用CD117 標記小鼠結腸Cajal 間質細胞,發現慢傳輸型便秘模型小鼠位于環行肌與縱行肌間隙中的CD117 標記Cajal 間質細胞數明顯減少,而理氣導滯法干預后其顯著上調,以高劑量組更明顯,表明理氣導滯法治療慢傳輸型便秘與增加結腸腸肌叢Cajal 間質細胞的數量密切相關。另外,造模后小鼠結腸c-kit 相對表達量明顯升高,而理氣導滯法干預后有所減低,以高劑量組更明顯。結合Grabarek［15］對正常人骨髓干細胞表面c-kit受體表達隨造血細胞發育成熟呈現變化的趨勢提示,理氣導滯法治療慢傳輸型便秘可能與Cajal 間質細胞,特別是成熟者的數量密切相關。