大黃素對慢性壓迫性損傷大鼠脊髓細胞因子的影響

王 琛, 吳智兵, 林興棟, 陳 鵬

(1.廣州中醫藥大學,廣東 廣州510400；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院,廣東 廣州510400；3.貴州中醫藥大學,貴州貴陽550000)

慢性壓迫性損傷動物模型為外周單一神經損傷模型［1］,其癥狀與人類因外周神經損傷而引起痛覺過敏相似,故該模型常用來進行神經病理性疼痛藥物療效評估及機制研究［2］,許多研究者對不同種類細胞因子在神經病理性疼痛中的作用表現出越來越多的關注［3］。

大黃是具有活血祛瘀、清泄濕熱作用的中藥,其成分中以大黃素為代表的蒽醌類物質具有顯著調節炎性細胞因子(如IL-1β、IL-10 等) 表達的作用［4-6］。前期課題組［7］報道,大黃素對慢性壓迫性損傷大鼠具有一定鎮痛作用；目前已有研究者發現,大黃素可抑制慢性壓迫性損傷模型中初級感覺神經元受體表達,從而起到了改善疼痛的作用［8］。因此,本實驗探討大黃素對慢性壓迫性損傷大鼠脊髓的影響,為其鎮痛機制研究提供實驗依據。

1 材料

SPF 級雄性健康SD 大鼠,體質量180～220 g,購于廣州中醫藥大學動物實驗中心,實驗動物生產許可證號SCXK(粵) 2013-0034。 大黃素 (含 有量＞98%, 批號MUST-15042711) 購于成都曼斯特生物科技有限公司。IL-1β、IL-10 抗體購于英國Abcam 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、固定液等試劑購于上海碧云天生物技術有限公司。2390 系列von Frey 電子測痛儀、390 爪刺激痛覺測試儀(美國IITC-Life Science 公司)；BX-60 光學顯微鏡、顯微攝像儀(日本Olympus 公司)；IPP6.0 軟件。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 42 只大鼠隨機分為假手術組、模型組、大黃素組,每組14 只,按照文獻［9］ 方法進行造模,在坐骨神經分叉處上5 mm 采用4-0 絲線間隔約1.0 mm進行4 次結扎。從術后第1 天開始,按照前期研究確定的劑量給藥［7］,大黃素(50 mg/kg) 灌胃,1 次/d,共15 d。

2.2 行為學測試 分別于造模前2 d 及造模后第3、7、11、15 天進行機械痛覺和熱痛覺測試以評估疼痛情況。上午10 點至下午6 點將大鼠置于檢測環境30 min 后,由不同實驗人員進行行為學測試,參考文獻［10］ 方法,將大鼠置于有機玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm) 中,底部為金屬網,電子測痛儀垂直刺激大鼠左側足底正中,逐漸加壓至其出現疼痛反應,表現為抬足或舔足,主機顯示屏上的機械縮足反射閾值。休息2 h 以上后參照文獻［11］ 方法,將大鼠置于有機玻璃箱(20 cm×15 cm×18 cm) 中,底部為玻璃板,熱輻射刺激儀移動到其后足正下方,按下開始鍵,大鼠感覺到疼痛出現抬足時停止,主機屏幕時間為熱縮足潛伏期,時間上限設置為20 s。每足機械縮足反射閾值、熱縮足潛伏期均測量5 次,每次間隔10 min,取平均值。

2.3 脊髓IL-1β、IL-10 陽性標記檢測 行為學測試后每組隨機取6 只大鼠,腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg) 麻醉,暴露心臟,插管灌流固定,先以0.9%氯化鈉溶液沖洗至流出液澄清,再以4%多聚甲醛灌流至四肢僵硬,暴露脊髓后,取出L4～L6 損傷側組織,浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定24 h；剩余大鼠于術后15 d 取材完畢。處理后的組織石蠟包埋,切片(片厚4 μm),放入片盒后于-20 ℃冰箱中保存。石蠟切片脫蠟水化后,PBS 緩沖液沖洗3 次,每次5 min 進行抗原修復。適當比例稀釋IL-1β、IL-10 一抗,37 ℃下孵育1 h 以上,PBS 緩沖液沖洗3 次,每次5 min,再加入生物素標記二抗,37 ℃下反應30 min。DAB 顯色,蘇木素復染5 min,鹽酸酒精分化,梯度酒精脫水,二甲苯透明,晾干,中性樹脂封片,用顯微鏡及顯微攝像儀對染色組織切片進行觀察,圖片通過IPP 6.0 軟件進行分析,每個切片隨機取5 個視野(×400),計算出陽性顆粒的平均光密度值。

2.4 脊髓IL-1β、IL-10 蛋白表達檢測 行為學測試后每組隨機取6 只大鼠,腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg) 麻醉,取出左側L4～L6 段脊髓,尖鑷于冰生理鹽水中將軟脊膜剝離,放入-80 ℃超低溫冰箱中備用；術后15 d 同法取出各組剩余大鼠損傷側脊髓。在脊髓組織中加入RIPA(強)裂解液(1 mg 組織∶20 μL 裂解液) 充分混勻、研磨,超聲裂解后,加入5×Loading Buffer 蛋白上樣緩沖液(5 ∶1),100 ℃煮沸5 min使其變性,13 000 r/min 離心5 min,取上清液,BCA 法進行蛋白定量。電泳分離蛋白后,轉膜至PVDF 膜,于脫脂牛奶室溫搖床下封閉1 h,4 ℃搖床下孵育IL-1β 抗體(1 ∶1 000)、IL-10(1 ∶1 000)、GAPDH 抗體(1 ∶1 000) 過夜,TBST 漂洗3 次,每次10 min,加入1∶40 000 稀釋二抗中,室溫下搖床孵育1 h,TBST 再漂洗3次,每次10 min,ECL 發光液顯色曝光,圖片通過IPP 6.0軟件進行分析。

2.5 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行重復測量方差分析,數據以表示,滿足方差齊性者組間比較采用LSD 法,不滿足者采用Dunnett's T3 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 行為學測試 表1 ～2、圖1 顯示,術后3、7、11 d,模型組大鼠機械痛、熱痛閾值較假手術組顯著降低(P＜0.01),大黃素組兩者較模型組顯著升高(P＜0.05,P＜0.01)；術后15 d,模型組兩者仍較假手術組顯著降低(P＜0.01),而大黃素組與模型組相比顯著升高 (P ＜0.01)。

表1 各組大鼠機械痛閾值比較（g，n=14）

表1 各組大鼠機械痛閾值比較（g，n=14）

注：與假手術組比較,＃＃P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

組別 基礎值 術后3 d 術后7 d 術后11 d 術后15 d假手術組 53.69±1.33 53.76±2.70 53.63±1.10 53.04±1.76 53.43±1.90模型組 54.31±1.23 34.17±3.75＃＃ 37.56±2.95＃＃ 35.79±1.88＃＃ 34.17±3.75＃＃大黃素組 54.11±0.90 40.72±3.06＃＃* 41.43±2.46＃＃** 42.58±1.64＃＃** 44.34±2.34＃＃**

表2 各組大鼠熱痛閾值比較（s，，n=14）

表2 各組大鼠熱痛閾值比較（s，，n=14）

注：與假手術組比較,＃＃P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

組別 基礎值 術后3 d 術后7 d 術后11 d 術后15 d假手術組 14.67±1.95 14.27±1.55 14.63±2.00 13.91±1.76 15.03±2.28模型組 15.22±1.84 7.72±0.80＃＃ 7.30±0.67＃＃ 7.86±0.68＃＃ 8.23±1.13＃＃大黃素組 15.13±1.79 8.53±1.16＃＃* 8.96±0.82＃＃** 9.43±1.43＃＃* 12.13±1.47＃＃**

圖1 各組大鼠機械痛閾值（A） 與熱痛閾值（B）

3.2 IL-1β、IL-10 陽性標記 圖2 ～3 顯示,術后7 d,模型組、大黃素組IL-1β 表達與假手術組相比顯著升高(P＜0.05),大黃素組IL-10 表達顯著高于假手術組、模型組(P＜0.05)；術后15 d,模型組IL-1β 表達仍顯著高于假手術組(P＜0.05),而大黃素組較假手術組、模型組顯著降低(P＜0.05),同時大黃素組、模型組IL-10 表達均較假手術組顯著降低(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠脊髓IL-1β 平均光密度值（×400）

圖3 各組大鼠脊髓IL-10 平均光密度值（×400）

3.3 IL-1β、IL-10 蛋白表達 圖4 ～5 顯示,術后7 d,模型組IL-1β 蛋白表達與假手術組相比顯著升高(P＜0.05),大黃素組較假手術組、模型組顯著升高(P＜0.05)；術后15 d,模型組IL-1β 蛋白表達仍顯著高于假手術組(P ＜0.05),大黃素組較假手術組、 模型組顯著降低 (P ＜0.05),但3 組IL-10 蛋白表達無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 各組大鼠脊髓IL-1β 蛋白表達

圖5 各組大鼠脊髓IL-10 蛋白表達

4 討論

大黃素具有有抗病毒、神經保護、抗炎、抗腫瘤等藥理作用,是大黃主要有效成分之一,也存在于蘆薈、何首烏等常用中草藥中［12-14］。在膠原誘導關節炎動物模型研究中發現,大黃素能通過抑制NF-κB 途徑來抑制巨噬細胞釋放炎癥因子［15-16］；在急性胰腺炎模型中,大黃素能通過抑制ER 壓力傳感器IRE1α 及其下游分子來阻止JNK、p38 MAPK 磷酸化,進而抑制IL-1β 釋放［17-18］,但關于大黃素鎮痛效果及其機制的報道相對較少。本研究將大黃素應用于慢性壓迫性損傷大鼠的治療,發現它在術后7 d 開始展現出一定鎮痛效果,至術后15 d 效果明顯優于模型組,而且對IL-1β、IL-10 有一定調節作用。

在慢性壓迫性損傷動物模型中,疼痛癥狀往往依賴于外周感覺纖維損傷后引發的脊髓背角中神經元異常興奮性反應,以及不同類型神經膠質細胞的激活［19-20］。細胞因子作為膠質細胞激活的下游因子,是一種非結構式蛋白,根據其生物活性可分為促炎性細胞因子(如IL-1 家族) 和抗炎性細胞因子(如IL-10 家族)。其中,膠質細胞激活后釋放促炎性細胞因子(如IL-1β 等),可增加脊髓背角神經元興奮性,并且提高其中NMDA 受體磷酸化水平,進而激活p38 MAPK,最終產生痛覺過敏癥狀［21］；IL-10 可降低NFκB 活性,導致包括IL-1β、TNF 在內的促炎性細胞因子水平衰減［22］。文獻［23-24］ 報道,降低IL-1β 水平可達到緩解疼痛的作用,而在慢性壓迫性損傷模型和紫杉醇引起的疼痛模型中注射外源性IL-10 時,可緩解異常性疼痛,表明神經病理性疼痛形成機制中IL-1β、IL-10 水平變化具有重要作用。本實驗采用免疫組化和Western blot 技術檢測慢性壓迫性損傷大鼠脊髓中IL-1β、IL-10 水平,發現前者顯著升高；術后7 d 大黃素灌胃后能促進后者,但15 d 時反而被抑制,同時在術后各個時間點行為學測定中,大黃素組大鼠痛覺過敏癥狀有所改善,與細胞因子檢測結果符合。由此認為,IL-1β、IL-10 作為2 類具有不同作用的細胞因子,參與了慢性壓迫性損傷大鼠術后痛覺過敏的形成。

綜上所述,大黃素可降低促炎性細胞因子IL-1β 水平、升高抗炎性細胞因子IL-10 水平,從而產生綜合性的效果,改善慢性壓迫性損傷大鼠疼痛癥狀。但不同細胞因子在諸多疾病形成機制中均有重要作用,故若要驗證大黃素抑制神經病理性疼痛的作用靶點,還需進行具體通路上、下游指標的檢測,如MAPK、NF-κB 等,從而為其作用機制探索提供更充足的實驗依據。