雞矢藤提取物對2 型糖尿病大鼠胰腺β 細胞內質網應激的影響

徐 錦, 梁志敏, 劉智君, 梁 韜, 鄭 妮, 陳 歡*

(1.玉林市中西醫結合骨科醫院,廣西 玉林537000；2.廣西醫科大學附屬口腔醫院,廣西 南寧530021；3.南方醫科大深圳醫院,廣東深圳518000)

糖尿病是一種由多種病因造成機體內高血糖的慢性代謝性紊亂疾病,發病率隨著人們生活質量提高、生活方式及飲食結構改變而升高,據國際糖尿病基金會預計,2030年我國糖尿病患者將增加到1.3 億,占總人口12.1%［1］。2型糖尿病約占糖尿病患者總數的80%,而機體外周組織胰島素抵抗、胰島β 細胞功能衰竭是其發展的兩大重要環節。胰島β 細胞具有高度發達的內質網,對內質網應激極為敏感,故其所誘導的細胞凋亡是細胞功能衰竭的重要因素［2-3］,也是2 型糖尿病發病的重要環節。由于糖尿病是以高血糖為基本特征的全身性疾病,發病過程中會出現許多并發癥,對患者、家庭、社會造成了不小的經濟負擔及壓力,故研發具有靶向性的相關藥物有著重要現實意義。

雞矢藤是茜草科草質藤本植物雞矢藤Paederia scandens(Lour.)Merr.干燥全草,其味甘、微苦,性平［4］,具有抗炎鎮痛、抗風濕、抗痛風、降血糖等藥理活性,在抗糖尿病治療上有著良好的效果,但其作用機制尚未明確［5］。本實驗考察雞矢藤提取物對2 型糖尿病大鼠胰腺β 細胞內質網應激的影響,為深入研究其機理提供實驗依據。

1 材料

1.1 試藥 雞矢藤購自廣西玉林市藥材市場,經廣西中醫藥研究院專家鑒定為茜草科多年生草質藤本植物雞矢藤Paederia scandens(Lour.)Merr.干燥全草,其提取物由本實驗室采用乙醇提取法制得。鏈脲佐菌素(STZ) 購自美國Sigma 公司,批號SO170-100 mg；二甲雙胍片購自北京京豐制藥有限公司,批號170622。胰島素ELISA 試劑盒購自美國Millipore 公司,批號C17084；一氧化氮(NO)、核因子-κB(NF-κB) ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司,批號1756725、1709124；活性氧(ROS) ELISA試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司公司,批號1705246；兔抗Tribble 同源蛋白3(TRIB3) 多克隆抗體購自德國Calbiochem 公司,批號17054；兔抗大鼠C/EBP 同源蛋白(CHOP) 高親和性單克隆抗體購自美國Sigma 公司,批號BI852。

1.2 儀器 卓越型血糖儀,購自瑞士羅氏公司；電泳儀,購自美國Bio-Rad 公司；9602A 酶標儀,購自北京艾普生物設備有限公司。

1.3 動物 SPF 級SD 大鼠,體質量(200±20) g,雌雄各半,由廣西醫科大學實驗動物中心提供,合格證號SCXK(桂)2015-0005。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥［6］大鼠造模前12 h 禁食不禁水,尾靜脈注射鏈脲佐菌素(60 mg/kg) 后高脂飼料喂養30 d。第31 天尾部取血,測定空腹血糖,以≥11.1 mol/L 為造模成功。大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組(320 mg/kg)、雞矢藤提取物組(1.25、2.5、5.0 g/kg),每組10 只,另設空白組10 只大鼠,普通飼料喂養,各組灌胃給藥4 周。

2.2 提取物制備 藥材干燥粉碎后,浸泡于10 倍量80%乙醇中1 h,75 ℃回流提取1 h,共2 次,濾過,合并濾液,減壓回收乙醇,真空條件下低溫干燥,即得。

2.3 指標檢測 血糖儀、ELISA 試劑盒法分別檢測初次給藥前及末次給藥后1 h 大鼠空腹血糖、血清胰島素水平。末次給藥前,大鼠禁食不禁水12 h,給藥后1 h 腹主動脈取血,高速離心分離血清。切取大鼠胰腺部分組織,浸泡于4%甲醛中固定1 周,石蠟包埋切片,HE 染色,顯微鏡下觀察。再切除部分胰腺組織,勻漿后ELISA 試劑盒法檢測NO、ROS、NF-κB 水平,Western blot 法檢測胰腺組織TRIB3、CHOP 蛋白表達。

2.4 統計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理,數據以表示,方差齊者組間比較采用t 檢驗,方差不齊者采用矯正t 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 雞矢藤提取物對空腹血糖的影響 表1 顯示,與空白組比較,模型組空腹血糖顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較,雞矢藤提取物組空腹血糖顯著下降(P＜0.05),并呈一定劑量依賴性。

表1 雞矢藤提取物對空腹血糖的影響n=10）

表1 雞矢藤提取物對空腹血糖的影響n=10）

注：與空白組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 (g劑·k量g-/1)給藥空前腹 血糖/(mmo給l·L藥-1后)空白組 — 7.56±0.84 7.41±1.08模型組 — 13.81±1.14* 14.52±1.29*二甲雙胍組 0.32 13.45±1.22* 10.47±1.81*＃雞矢藤提取物組 1.25 12.98±1.63* 11.45±1.26*＃雞矢藤提取物組 2.5 13.26±1.49* 10.93±1.18*＃雞矢藤提取物組 5.0 13.17±1.58* 10.38±1.46*＃

3.2 雞矢藤提取物對大鼠胰腺組織的影響 圖1 顯示,空白組大鼠胰腺組織細胞結構完整飽滿；模型組大鼠胰腺細胞有大量結構變形及萎縮情況,并伴有炎性細胞浸潤；二甲雙胍組、雞矢藤提取物組大鼠胰島細胞結構變形、萎縮情況有所改善,損傷胰島有所減緩。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理變化（×400）

3.3 雞矢藤提取物對血清胰島素的影響 表2 顯示,與空白組比較,模型組血清胰島素水平顯著降低(P＜0.05)；與模型組比較,雞矢藤提取物組其水平顯著升高 (P ＜0.05)。

表2 雞矢藤提取物對血清胰島素的影響n=10）

表2 雞矢藤提取物對血清胰島素的影響n=10）

注：與空白組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 劑量/(g·kg-1) 胰島素/(mIU·mL-1)空白組 — 22.86±4.72模型組 — 10.73±2.05*二甲雙胍組 0.32 18.45±3.81*＃雞矢藤提取物組 1.25 13.36±4.06*＃雞矢藤提取物組 2.5 15.09±2.79*＃雞矢藤提取物組 5.0 18.51±2.57*＃

3.4 雞矢藤提取物對NO、ROS、NF-κB 水平的影響 表3顯示,與空白組比較,模型組NO、ROS、NF-κB 水平顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較,雞矢藤提取物組三者水平顯著降低(P＜0.05)。

3.5 雞矢藤提取物TRIB3、CHOP 蛋白表達的影響 表4、圖2 顯示,與空白組比較,模型組TRIB3、CHOP 蛋白表達顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較,雞矢藤提取物組兩者蛋白表達顯著下降(P＜0.05),并呈一定劑量依賴性。

4 討論

內質網是細胞內蛋白質合成、加工修飾、質量監控的重要場所,能保持細胞內Ca2+穩態平衡,確保細胞功能正常運行［7］。內質網應激是真核細胞的一種保護性應激反應,但使內質網持續性處于應激狀態時則可激活細胞的凋亡通路,觸發細胞凋亡［8-9］。胰島β 細胞具有高度發達的內質網,其蛋白質合成和分泌功能旺盛,使得β 細胞對內質網應激極為敏感,在2 型糖尿病發展中它長期處于高糖環境下,會造成其細胞內的內質網處于持續性、長期性應激反應,誘導細胞功能衰竭,減少細胞數,故內質網應激在2型糖尿病病程中可引起胰島β 細胞功能衰竭及凋亡。

表3 雞矢藤提取物對NO、ROS、NF-κB 水平的影響n=10）

表3 雞矢藤提取物對NO、ROS、NF-κB 水平的影響n=10）

注：與空白組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 劑量/(g·kg-1) NO/(μmol·L-1) ROS/(U·mL-1) NF-κB/(pg·mL-1)空白組 — 0.53±0.07 216.57±21.73 86.34±7.41模型組 — 1.18±0.14* 423.98±36.17* 159.27±12.73*二甲雙胍組 0.32 0.75±0.09*＃ 263.75±24.82*＃ 107.43±13.82*＃雞矢藤提取物組 1.25 1.02±0.18* 372.66±29.05*＃ 138.26±11.09*＃雞矢藤提取物組 2.5 0.88±0.11*＃ 313.51±27.38*＃ 112.95±13.64*＃雞矢藤提取物組 5.0 0.71±0.13*＃ 274.25±19.89*＃ 94.56±10.75*＃

表4 雞矢藤提取物對TRIB3、CHOP 蛋白表達的影響

表4 雞矢藤提取物對TRIB3、CHOP 蛋白表達的影響

注：與空白組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 (g劑·k量g-/1) TRIB3 CHOP空白組 — 0.35±0.04 0.78±0.14模型組 — 0.82±0.08* 1.39±0.25*二甲雙胍組 0.32 0.56±0.03*＃ 1.01±0.19*＃雞矢藤提取物組 1.25 0.67±0.05*＃ 1.15±0.15*＃雞矢藤提取物組 2.5 0.58±0.05*＃ 1.06±0.24*＃雞矢藤提取物組 5.0 0.51±0.04*＃ 0.92±0.17*＃

圖2 各組TRIB3、CHOP 蛋白表達

在2 型糖尿病狀態下,胰島組織中會有大量炎癥因子產生,從而出現炎癥級聯反應,會直接或間接作用于胰腺并損傷胰島β 細胞。NF-κB 是一種介導糖尿病炎癥反應的炎癥因子,起著中心調控作用,其高表達時會促進胰島β細胞凋亡,從而導致胰島功能障礙,出現高血糖［10］,它不僅與炎癥反應密切相關,還與細胞增殖、存活有著密切關系［11］。2 型糖尿病狀態下胰島β 細胞中,NF-κB 高表達可能啟動組織中iNOS 因子活性,進而誘導NO 生成,觸發內質網應激反應,造成胰島β 細胞損傷,導致細胞凋亡。

TRIB3 是重要的應激反應相關蛋白,能通過調控下游的炎癥因子、氧化因子、營養因子等來參與調節細胞增殖、遷移、凋亡等功能,在內質網應激狀態下抑制其表達可明顯降低應激損傷所造成的細胞凋亡［12］。NF-κB 是TRIB3 蛋白下游因子,后者表達能調控前者活性［13］,在內質網應激反應時后者表達增加,可提高前者活性,促進iNOS 表達進而誘導NO 生成,造成胰島β 細胞損傷。另外,胰島組織中TRIB3 蛋白高表達時,能使細胞內ROS 產生量增多,引起胰島β 細胞生物膜脂質過氧化,細胞內蛋白、酶變性,DNA 損害,從而損傷β 細胞及凋亡［14］,與本實驗結果吻合。

CHOP 作為C/EBP 轉錄因子家族成員,是內質網應激特異的轉錄因子,也是由抗調亡向促調亡轉換的主要信號分子。當內質網處于普通狀態時,CHOP 蛋白處于低表達狀態,而當受內質網應激時其表達會增加,故其可作為衡量糖尿病動物胰島內質網應激反應的指標［15］。

本實驗發現,雞矢藤提取物能顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖,提高胰島素分泌水平,改善受損胰腺中胰島結構及形態；胰腺組織中NO、ROS、NF-κB 水平下降,TRIB3、CHOP 蛋白表達均降低,提示其降血糖作用機制可能為下調胰腺組織TRIB3、CHOP 蛋白表達,降低下游因子NF-κB活性,減少NO、ROS 水平,延緩內質網應激對胰島造成的損傷,從而達到治療糖尿病的目的。