蒽酮-硫酸法測定復方木雞顆粒中粗多糖

謝心文, 門 磊,2*, 孫 怡, 顧 喆, 寇佳怡, 魏溪垚

(1.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連116600；2.大連民族大學生物技術與資源利用教育部重點實驗室,遼寧大連116600)

復方木雞顆粒來源于滿族民間驗方“木雞湯”,收載于《中藥成方制劑》 第十六冊,其療效確切,具有扶正清熱解毒功效,能抑制甲胎蛋白升高,調節免疫功能,臨床上用于治療原發性肝癌、肝硬化、肝炎等肝臟疾病。它由云芝提取物、核桃楸皮、山豆根、菟絲子4 味藥材制成,每味藥中都含有多糖［1-7］。

目前研究發現,中藥多糖具有多種生理活性,具有較好調節腫瘤免疫應答作用［8-10］,復方木雞顆粒中該成分很可能是其保肝作用的重要藥效物質基礎,但現行標準缺少其含有量測定項。因此,本實驗采用蒽酮-硫酸法測定復方木雞顆粒中粗多糖的含有量,為該制劑質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器 UV-2600 型紫外分光光度計(日本島津公司)；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)；MS 1 Minishakers ［艾卡 (廣州) 儀器設備有限公司］；PL203 型電子精密天平［梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司］。

1.2 試藥 復方木雞顆粒(每袋裝10 g),購自丹東藥業集團有限公司,批號170201、170203、170101、170304、170303、170301。葡萄糖對照品(含有量≥99.8%,北京索萊寶科技有限公司,批號1102A0936)。硫酸為優級純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖對照品100 mg,置于100 mL 量瓶中,蒸餾水溶解定容,搖勻,得1 mg/mL 貯備液,精密量取適量,加水稀釋,即得(0.1 mg/mL)。

2.2 供試品溶液制備 將顆粒研磨至粉末狀,精密稱取0.5 g,加入50 mL 無水乙醇,70 ℃下加熱回流2 h,濾過,殘渣揮至無醇味,將殘渣、濾紙置于燒瓶中,加入50 mL水,80 ℃下回流提取2 次,每次2 h,趁熱過濾,殘渣、燒瓶用熱水洗滌,洗液與濾液合并,濃縮轉移至100 mL 量瓶中,蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,精密量取0.2 mL 至50 mL量瓶中,蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.3 檢測波長確定 精密量取0.1 mg/mL 對照品溶液2.0 mL,置于20 mL 帶塞試管中,加入0.1%蒽酮-硫酸溶液,渦旋混勻,水浴加熱15 min,冰水冷卻15 min；另取2.0 mL 蒸餾水同法操作,作為空白對照,于400 ～800 nm波長處進行掃描。最終確定,檢測波長為626 nm。

2.4 顯色條件優化

2.4.1 單因素試驗

2.4.1.1 蒽酮-硫酸溶液體積分數 取0.1 mg/mL 葡萄糖對照品溶液5 份,每份2 mL,分別加入0.1%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%蒽酮-硫酸溶液,渦旋混勻,水浴加熱20 min 后冰水冷卻20 min,在626 nm 波長處測定吸光度,平行3 份,結果見圖1,可知體積分數0.2%時吸光度最大。

2.4.1.2 蒽酮-硫酸溶液用量 取0.1 mg/mL 葡萄糖對照品溶液5 份,每份2 mL,置于20 mL 具塞試管中,分別加入0.2%蒽酮-硫酸溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,渦旋混勻,水浴加熱20 min 后取出,冰水冷卻20 min,在626 nm 波長處測定吸光度,平行3 份,結果見圖1,可知用量6 mL 時吸光度最大。

2.4.1.3 水解時間 取0.1 mg/mL 葡萄糖對照品溶液5份,每份2 mL,置于20 mL 具塞試管中,加0.20%蒽酮-硫酸溶液6.0 mL,渦旋混勻后水浴加熱水解,時間分別為5、10、15、20、30 min,取出后冰水冷卻20 min,在626 nm波長處測定吸光度,平行3 份,結果見圖1,可知水解20 min時吸光度最大。

2.4.1.4 冷卻時間 取0.1 mg/mL 葡萄糖對照品溶液5份,每份2 mL,置于20 mL 帶塞試管中,加入0.20%蒽酮-硫酸溶液6.0 mL,渦旋搖勻,水浴加熱20 min 后取出,冰水冷卻,時間分別2、5、10、15、20 min,在626 nm 波長處測定吸光度,平行3 份,結果見圖1,可知冷卻5 min 時吸光度最大。

圖1 各因素對吸光度的影響

2.4.2 正交試驗 在“2.4.1” 項下結果基礎上,以蒽酮-硫酸溶液體積分數(A)、蒽酮-硫酸溶液用量(B)、水解時間(C)、冷卻時間(D) 為影響因素,每個因素3 個水平,L9(34) 正交試驗優化,因素水平見表1。由此可知,因素C、D 對顯色效果的影響較大,B、A 次之,最優顯色條件為A1B2C2D3,即蒽酮-硫酸溶液體積分數0.15%,蒽酮-硫酸溶液用量6.0 mL,水解時間10 min,冷卻時間10 min。

表1 因素水平

2.5 線性關系考察 精密吸取0.1 mg/mL 葡萄糖對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL,置于25 mL 具塞試管中,補水至2 mL,冰浴中加入6 mL 0.15%蒽酮-硫酸溶液,渦旋混勻,沸水浴加熱10 min 后冰水浴冷卻10 min,于626 nm 波長處測定吸光度,平行3份,空白調零。以葡萄糖含有量為橫坐標(X),吸光度為縱坐標(A) 進行回歸,得方程為A ＝0.008 39C-0.001 15(r ＝0.999 1),在10 ～60 μg/mL 范圍內呈現良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 精密稱取顆粒(批號160601) 0.5 g,按“2.2” 項下方法制備供試品溶液,精密量取2 mL,置于25 mL 具塞試管中,按“2.5” 項下方法于626 nm 波長處測定吸光度,平行5 次,測得其RSD 為0.85%,表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 精密稱取顆粒(批號160601) 0.5 g,按“2.2” 項下方法制備供試品溶液,精密量取2 mL,置于25 mL 具塞試管中,按“2.5” 項下方法于626 nm 波長處測定吸光度6 次,每個樣品重復3 次,測得其RSD 為0.76%,表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的顆粒(批號160601)0.5 g,按“2.2” 項下方法制備供試品溶液,精密量取2 mL,置于25 mL 具塞試管中,加入0.1 mg/mL 葡萄糖對照品溶液0.4 mL,按“2.5” 項下方法于626 nm 波長處測定吸光度6 次,每個樣品重復3 次,計算回收率,結果見表2。

2.9 樣品含有量測定 取7 批顆粒,按“2.2” 項下方法制備供試品溶液,按“2.5” 項下方法于626 nm 波長處測定吸光度,計算含有量,結果見表3。

3 討論

在提取方法選擇上,本實驗嘗試了超聲提取、浸提、回流提取,但浸提操作繁瑣,易導致數據誤差較大；超聲提取盡管操作方便,但超聲過程和多糖結構差異會影響提取效率,并導致多糖降解［11］,故最終采用回流提取法提取復方木雞顆粒中粗多糖。同時,為了消除木脂素、單糖等雜質對多糖質量分數測定的影響,先采用乙醇回流提取以去除雜質。

表2 粗多糖加樣回收率試驗結果（n=6）

表3 粗多糖含有量測定結果

蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法是測定多糖含有量較經典有效的方法,但后者還需制備5%苯酚,而且該成分易氧化；前者在回歸方程線性關系、穩定性、重復性方面均優于后者［12］。因此,本實驗采用蒽酮-硫酸法,并優選了顯色條件,可為相關測定條件選擇提供參考。

多糖是中草藥有效成分之一,主要從調節免疫功能,激活網狀內皮系統、巨噬細胞等方面生成抗體,增強干擾素、淋巴因子等細胞因子,最終全面提升機體免疫功能［13］。目前,復方木雞顆粒在臨床上已廣泛用于治療肝炎,但其所含多糖的具體藥理作用尚不明確,尚需進一步研究。