石斛枸杞方水提工藝的優化

張周菊, 張 悅, 彭翠香, 孔菲菲, 梁 璐

(湖北省醫藥工業研究院有限公司,湖北 武漢430061)

石斛枸杞方由鐵皮石斛、黃精、枸杞子、百合等中藥組成,具有補肺益氣、健脾益氣、補腎填精等功效,用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱、目暗不明,筋骨痿軟等癥。本實驗采用正交試驗,以石斛枸杞方干膏中甘露糖、多糖轉移率為評價指標,優化水提工藝；以粗多糖總量為評價指標,優化黃精、枸杞子、百合提取工藝,以期保證該方質量和療效。

1 材料

AB265-S 電子天平(十萬分之一)、AL204 電子天平(萬分之一) (瑞士Mettler-Toledo 公司)；UV2450 紫外分光光度計、AT20 高效液相色譜儀(日本島津公司)；Thermo Scientific ST16R 離心機；Eppendoff Reseach Plus 移液器。D-甘露糖 (批號140651-201504)、 D-無水葡萄糖 (批號110833-201506) 對照品(中國食品藥品檢定研究院)。鐵皮石斛由湖北英山縣紫楹石斛產業有限公司惠贈,經湖北中醫藥大學藥學院陳科力教授鑒定為蘭科植物石斛屬植物鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo；黃精、百合、枸杞子均購自湖北格林藥業有限公司,經專家鑒定為正品,均符合2015 年版《中國藥典》 一部項下有關規定。

2 方法與結果

2.1 工藝設計 由于鐵皮石斛所含成分不易煎出,故將其單獨水煎煮提取,而黃精、百合、枸杞子合并后水煎煮提取。

2.2 甘露糖含有量測定

2.2.1 色譜條件［1］填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨(26 ∶74)；檢測波長250 nm。理論塔板數以甘露糖峰計,應不低于4 000。

2.2.2 校正因子測定 精密稱取鹽酸氨基葡萄糖適量,加水制成每1 mL 含12 mg 該成分的溶液,作為內標溶液。另精密稱取甘露糖對照品約10 mg,置于100 mL 量瓶中,精密加入1 mL 內標溶液,加適量水溶解并稀釋至刻度,搖勻,吸取400 μL,加0.5 mol/L PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮) 甲醇溶液、0.3 mol/L 氫氧化鈉溶液各400 μL,混勻,70 ℃水浴反應100 min,再加入0.3 mol/L 鹽酸溶液500 μL,混勻,三氯甲烷洗滌3 次,每次2 mL,水層離心,取上清液10 μL,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,計算校正因子。

2.2.3 供試品溶液制備 取提取物適量,置于100 mL 量瓶中,精密加入內標溶液2 mL,加水至刻度,搖勻,離心,吸取上清液1 mL, 置于安瓿瓶或頂空瓶中, 加3.0 mol/L鹽酸溶液0.5 mL,封口,混勻,110 ℃水解1 h,放冷,3.0 mol/L 氫氧化鈉溶液調節pH 值至中性,吸取400 μL,按“2.2.2”項下方法操作,取上清液10 μL,即得。

2.2.4 線性關系考察 精密稱取甘露糖適量,置于100 mL量瓶中,配制0.5 mg/mL 貯備液,精密吸取0.2、0.4、1、2、3、4 mL 至10 mL 量瓶中,制備0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL 對照品溶液,精密加入“2.2.2”項下內標溶液0.1 mL,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標(X),對照品、內標峰面積之比為縱坐標(Y) 進行回歸,得方程為Y ＝11.765X+0.052 3(r＝0.999 5),在10.1 ～202.1 μg/mL 范圍內線性關系良好。色譜圖見圖1。

2.3 粗多糖含有量測定［2］

2.3.1 線性關系考察 精密稱取D-無水葡萄糖對照品適量,加水制成每1 mL 含90 μg 該成分的溶液,精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于10 mL 具塞試管中,加水至1.0 mL,精密加入5%苯酚溶液1 mL(臨用配制),搖勻,再精密加入硫酸5 mL,搖勻,沸水浴中加熱20 min,取出,冰浴中冷卻5 min。以相應試劑為空白,采用紫外-可見分光光度法(《中國藥典》附錄VA)在488 nm 波長處測定吸光度,以其為縱坐標(A),溶液質量濃度為橫坐標(X)進行回歸,得方程為A＝0.009 2X+0.002 7(r＝0.999 5),在20.92～104.6 μg/mL 范圍內線性關系良好。

圖1 甘露糖HPLC 色譜圖

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取干浸膏適量,加水溶解并轉移至50 mL 量瓶中,加水至刻度,搖勻,濾過,精密量取續濾液液2 mL,置于15 mL 離心管中,加10 mL 無水乙醇,搖勻,冷藏1 h,取出離心,棄去上清液,沉淀用80%乙醇洗滌2 次,每次8 mL,棄去上清液,沉淀加水溶解,轉移至25 mL 量瓶中,稀釋至刻度,搖勻。精密吸取1 mL,置于10 mL 具塞試管中,按“2.3.1” 項下方法測定吸光度,計算多糖含有量(以D-無水葡萄糖計)。

2.4 鐵皮石斛水提工藝優化

2.4.1 吸水量考察 稱取藥材粗粉15 g,加入500 mL 水攪拌,浸泡1 h 后濾過,得未被吸收的水液280 mL。結果,15 g 藥材粗粉吸水量為220 mL,即約為14.6 倍,故本實驗先加入15 倍量水補足藥材吸水量。

2.4.2 優化方法 稱取藥材粗粉9 份,每份20 g,以多糖、甘露糖轉移率為評價指標,浸泡時間(A,提取前加15 倍量水,根據各組設定時間浸泡)、加水量(B)、提取時間(C) 作為影響因素,L9(34) 正交試驗優化水提工藝。因素水平、結果、方差分析分別見表1～3。

表1 鐵皮石斛水提工藝因素水平

表2 鐵皮石斛水提工藝試驗設計及結果

表3 鐵皮石斛水提工藝方差分析

由表可知,各因素影響程度依次為C＞B＞A,即浸泡時間(A) 對轉移率影響最小,故選擇1 h,而提取時間(C) 有顯著影響(P＞0.05)。因此,確定最優工藝為鐵皮石斛粗粉加15 倍量水補足吸水量后浸泡1 h,提取3 次,每次加12 倍量水。

2.5 枸杞、百合、黃精水提工藝優化

2.5.1 吸水量考察 稱取3 味藥材共78 g,加入500 mL水浸泡至藥材全部浸透,濾過,得未被吸收的水液340 mL。結果,78 g 藥材粗粉吸水量為160 mL,即約為2 倍,故本實驗先加入2 倍量水補足藥材吸水量。

2.5.2 優化方法 按處方比例稱取3 味藥材9 份,每份130 g,以粗多糖含有量為指標,加水量(A)、浸泡時間(B)、提取時間(C) 作為影響因素,L9(34) 正交試驗優化水提工藝。因素水平、結果、方差分析分別見表4～6。

表4 枸杞、百合、黃精水提工藝因素水平

由表可知,各因素影響程度依次為B＞A＞C,以加水量(A)、浸泡時間(B) 更顯著(P＜0.05)。因此,確定最優工藝為3 味藥材加2 倍量水浸泡1 h 后,12 倍量水提取2次,每次6 倍量,提取時間分別為2、1 h,實際提取時,將補足吸水量所需2 倍量水與第一次提取所需6 倍量水合并加入浸泡,即加8 倍量水浸泡1 h 后進行第1 次提取。

2.6 鐵皮石斛水提工藝驗證試驗 稱取藥材60 g,按“2.4.2” 項下優化工藝提取,重復3 次。結果,收膏率為38.13%,多糖含有量為 57.70%, 轉移率為 61.79%(RSD＝1.30%)； 甘露糖含有量為32.69%, 轉移率為61.47% (RSD＝1.99%),表明工藝穩定可行。

2.7 枸杞子、黃精、百合水提工藝驗證試驗 按處方比例稱取3 味藥材共390 g,按“2.5.2” 項下優化工藝提取,重復3 次。結果,收膏率為42.14%；粗多糖含有量為68.84%,總量為107.178 g(RSD＝2.30%),表明工藝穩定可行。

3 討論

中藥提取一般采用分次方式,理論上增加浸提次數可提高藥材成分浸出總收率,但浸提次數越多,收率愈低,而且會盲目增加提取時間,造成能量消耗、勞動力投入加大,從而使得生產成本增加［3］,故中藥提取工藝研究一般要考察提取次數。但在正交試驗中,提取次數作為影響因素會改變其他因素水平,使原本四因素三水平變為四因素多水平,不符合均勻分散、整齊可比的性質［4-5］,而且直接造成總溶劑量過大、浸泡時間和提取時間過長等問題,導致優選工藝參數不符合實際生產。

表5 枸杞、百合、黃精水提工藝試驗設計及結果

表6 枸杞、百合、黃精水提工藝方差分析

近年來,已有較多文獻將提取次數單獨考察,而不納入正交試驗中［6-11］,這樣加水量、浸泡時間、提取時間均為3 個水平,不會因為該因素影響而出現多個水平,安排合理,不違反試驗特性。一般情況下,根莖類藥材提取2～3 次時基本上可將70%～80%成分提取到溶劑中［12］,故本實驗設置提取次數1、2、3 次,然后將其與提取時間合并作為1 個因素,這樣既避免了該因素對其他因素的影響,又可在不增加試驗次數的前提下同時對其進行考察。

4 結論

鐵皮石斛最優水提工藝為藥材加15 倍量水補足吸水量后浸泡1 h,加水量36 倍(提取3 次,每次12 倍量),提取時間6 h(每次2 h)；黃精、枸杞子、百合最優水提工藝為加2 倍量水補足吸水量后浸泡1 h,加水量12 倍(提取2 次,每次6 倍量),提取時間3 h(第1 次2 h,第2 次1 h)。經驗證、小試、中試放大試驗發現,所測指標均較穩定,表明工藝穩定可行。