一測多評法同時測定蜘蛛果中3 種成分

劉夢鴿, 徐文芬, 孫慶文, 楊 杭, 劉恩穩

(貴州中醫藥大學,貴州 貴陽550002)

蜘蛛果來源于桔梗科金錢豹屬多年生植物長葉輪鐘草Campanumoea lancifolia(Roxb.)Kurz 的干燥根,又稱“紅果參” “山荸薺” “算盤果” 等。味甘而微苦,性平,具有潤肺止咳、理氣、補虛、祛瘀止痛等功效,主要用于治療跌打損傷、氣虛乏力、腸絞痛、肺癆咳嗽、疝氣等癥［1-2］。其根在民間常作為滋補草藥,嫩葉可作為蔬菜炒食,果實可作為水果食用,有一定的保健功效［3］。對蜘蛛果藥材的研究相對較少,主要集中在其化學成分及抗氧化活性的研究［4-9］,在質量控制方面仍處于空白,不利于控制藥材及其成方制劑的質量,無法保證臨床用藥的安全性和有效性,并限制了對蜘蛛果的進一步開發利用。

中藥的化學成分種類繁多,且各成分之間相輔相成,而中藥的質量長期以來多以單一指標進行控制,難以真正體現中藥的多效性和整體性。中藥多靶點的作用特點要求對其進行多成分質量控制,一測多評(QAMS) 中藥質量評價模式為解決該矛盾提供了新思路。QAMS 法是現代發展起來的1 種分析技術和方法［10］,即利用有效化學成分間內在的函數和比例關系,測定1 個成分(對照品可廉價易得者),實現對多個成分(對照品沒有或難以得到者) 的同步監控,使中藥質量評價更簡便并節約成本,可客觀評價中藥的質量。目前,QAMS 法已廣泛應用于中藥材及中藥制劑的質量控制研究中,用于解決缺乏對照品的問題［11-19］。

蜘蛛果為2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》 修訂的新增補品種。 本研究應用QAMS 法以供應量大、價格較低的綠原酸對照品為參照物,通過建立其與木犀草素、芹菜素的相對校正因子進行含有量計算,以降低檢測成本和時間,并為該藥材質量標準的制定、合理開發利用資源等提供研究基礎。

1 材料

Agilent 1100 型和1260 型高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)；島津LC-2030 型高效液相色譜儀(日本島津公司)；Thermo UItiMate 3000 型高效液相色譜儀(美國賽默飛公司)；AG135 型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)；SG8200HFT 型超聲儀(上海冠特超聲儀器有限公司)；202-1A 型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；DK-98-Ⅱ型水浴鍋 (天津市泰斯特儀器有限公司)；色譜柱：Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent ZORBAX XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、 Agilent ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Agilent ZORBA XSB-CN(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 均 購 自 美 國 Agilent 公 司；Pntulips BP-C18(4.6 mm×250 mm,5μm) 等。

綠原酸對照品(批號110753-201716,含有量99.3%)、木犀草素對照品(批號111520-201605,含有量99.6%)、 芹菜素 (批號111901-201603,含有量99.2%) 均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈(天津市科密歐化學試劑有限公司,色譜純)；磷酸(重慶川東化工有限公司,分析純)；實驗用水為重蒸餾水； 其他試劑均為分析純。

17 批蜘蛛果藥材分別由課題組采自貴州龍里、獨山、開陽、梵凈山以及廣西省融水等地,經貴陽中醫學院孫慶文教授鑒定為長葉輪鐘草Campanumoea lancifolia(Roxb.)Kurz,按地上部分和地下部分分別處理,藥材均搶水洗,50 ℃烘干,粉碎,置于硅膠干燥器中備用,見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Pntulips BP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -甲醇(B) -0.1%磷酸(C),梯度洗脫,程序見表2；體積流量1.0 mg/mL；檢測波長340 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 對照品溶液制備 取綠原酸、木犀草素、芹菜素對照品適量,50%甲醇溶解并制成質量濃度分別為1.405、0.202 0、0.206 0 mg/mL 的貯備液,吸取2.0、2.5、0.5 mL,置于5 mL 量瓶中,定容,即得(三者質量濃度分別為0.562 0、0.101 0、0.020 6 mg/mL)。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末1.0 g,精密稱定,置于50 mL 錐形瓶中,精密加入50%甲醇10 mL,超聲(100 W、40 Hz)提取60 min,取出放至室溫,濾過,續濾液過0.45 μm 微孔濾膜,即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統適應性及專屬性考察試驗 精密吸取“2.2” 項下對照品溶液和“2.3” 項下供試品溶液各10 μL,在“2.1.1” 項色譜條件下測定,記錄色譜圖。結果表明,供試品圖譜中1、2、3 號色譜峰的保留時間與混合對照品溶液一致,且UV 光譜圖曲線相同, 其純度因子分別為 999.916、999.891、999.155,表明該方法具有良好的專屬性,結果見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下對照品溶液,分別稀釋成系列質量濃度(綠原酸,0.351 3、0.175 6、0.087 80、0.043 90、0.022 00 mg/mL；木犀草素,0.101 0、0.050 50、0.025 25、0.012 62、0.006 312 mg/mL；芹菜素,0.041 20、0.016 48、0.006 592、0.002 637、0.000 527 4 mg/mL),在“2.1” 項色譜條件下測定,平行3 次。以對照品進樣量為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y) 進行回歸,結果見表3。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗 精密吸取“2.2” 項下對照品溶液10 μL,在“2.1” 項色譜條件下連續進樣6 次,測得綠原酸、木犀草素、芹菜素峰面積RSD分別為0.26%、0.74%、0.26%,表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(Z7)10 μL,在“2.1” 項色譜條件下于0、3、6、8、12、24、48 h 進樣,測得綠原酸、木犀草素、芹菜素峰面積RSD 分別為0.67%、1.51%、1.94%,表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取同一樣品(Z7) 6 份,每份約1.0 g,精密稱定,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣,測得綠原酸、木犀草素、芹菜素含有量RSD 分別為2.59%、1.41%、2.55%,表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取含有量已知的藥材粉末(Z7)6 份,每份約0.5 g,精密稱定,分別精密加入綠原酸、木犀草素、芹菜素對照品溶液適量,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液, 在“2.1” 項色譜條件下測定,測得三者平均加樣回收率分別為96.00%、96.34%、95.93%,RSD 分別為1.54%、2.45%、2.53%。

2.5 相對校正因子 取“2.2” 項下對照品溶液,精密吸取2、4、6、8、10、12 μL,在“2.1” 項色譜條件下進樣,以綠原酸為內標,根據校正因子公式fsi＝fs/fi＝ (As×Ci) / (Ai×Cs) (As、Cs分別為內參物的峰面積和濃度,Ai、Ci分別為待測成分的峰面積和濃度,fsi為待測成分的相對校正因子)分別計算綠原酸對木犀草素和芹菜素的相對校正因子(fS/B為木犀草素的相對校正因子,fS/C為芹菜素的相對校正因子),發現其RSD 均小于5.0%,見表4。

表4 木犀草素、芹菜素校正因子（n=6）Tab.4 Relative correlation factors of luteolin and apigenin（n=6）

2.6 耐用性考察

2.6.1 儀器、色譜柱 選擇4 種型號高效液相色譜儀和3 種型號色譜柱,精密吸取“2.2”項下對照品溶液10 μL,在“2.1”項色譜條件下進樣,測得木犀草素、芹菜素相對校正因子分別在0.578～0.617、0.471～0.551 之間,不同儀器、色譜柱相對校正因子RSD 分別為2.222%、3.793%,表明對各成分相對校正因子無顯著性影響,結果見表5。

2.6.2 待測組分色譜峰定位 本實驗考察4 個實驗室中不同型號儀器、色譜柱下的保留時間差和相對保留時間,發現各成分保留時間差波動較小,RSD 分別為1.93%、3.03%；相對保留時間波動較大,RSD 分別為6.25%、5.39%,因此采用保留時間差法定位木犀草素、 芹菜素色譜峰, 結果見表5。

2.7 樣品含有量測定 取17 批樣品,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣,分別采用外標法和一測多評法計算3 種成分的含有量,并對2 種方法測定值進行比較,結果見表6。

表5 相對校正因子、保留時間差和相對保留時間考察結果（n=3）Tab.5 Results of investigation on relative correlation factors，retention time differences and relative retention time（n=3）

3 討論

3.1 流動相優化 本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水流動相系統,發現峰形較差。在此基礎上,又考察了甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-0.2%磷酸、甲醇-乙腈-0.1%磷酸流動相體系及其比例,結果顯示,以甲醇-乙腈-0.1 磷酸水為流動相時,待測成分色譜峰峰形較好,分離度≥1.5。

3.2 檢測波長篩選 本實驗對綠原酸、木犀草素、芹菜素溶液進行全波長掃描時發現, 三者在340 nm波長下均有較好的吸收,而且基線平穩,色譜峰峰形較好,故選擇其作為檢測波長。

3.3 制備方法優化 本實驗考察了提取溶劑(50%、75%、95%甲醇,75%乙醇)、 制備方式(超聲、回流提取)、提取時間(30、45、60 min)等,以各成分提取率和色譜峰分離情況為指標,同時考慮到樣品制備的便捷性,最終確定供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min。

表6 一測多評法與外標法含有量測定結果比較（n=3）Tab.6 Comparison of content determination results obtained by ESM and QAMS methods（n=3）

4 結論

本實驗建立一測多評法同時測定蜘蛛果藥材中綠原酸、 木犀草素、 芹菜素的含有量。 再采用SPSS16.0 軟件,對外標法和一測多評法所測的蜘蛛果中木犀草素、芹菜素含有量進行獨立樣本t 檢驗,結果P＞0.05,表明2 種方法所得結果無顯著性差異,準確可靠。而且,該方法簡單、快速、準確,相對校正因子具有良好的可信度和準確度,同時有效降低了分析成本,可為該藥材質量標準的建立提供有力支持。

此外,不同采收時間的蜘蛛果中3 種成分含有量均存在顯著差異。據現有數據可知,從1 月到7月呈下降趨勢；不同產地采收的藥材中3 種成分含有量同時高或同時低,其變化趨勢相同,見圖2 ～3,可初步判斷不同采收期、產地對其影響較大,不同季節、環境因素也可能影響其變化,但還需要更多樣本來驗證此推斷。本研究結果對蜘蛛果種質資源引種、規范化種植、采收時間等方面研究提供了前期基礎。

圖2 不同采收期樣品中3 種成分含有量變化趨勢Fig.2 Trends of content changes of three constituents in samples at different picking time

圖3 不同產地樣品中3 種成分含有量變化趨勢Fig.3 Trends of content changes of three constituents in samples from different growing areas