小檗堿對A549 細胞增殖、遷移和侵襲的影響

邱勝衛, 王 彬, 蔡乃亮

(1.海南省三亞市人民醫院中醫科,海南 三亞572000；2.海南省三亞市人民醫院呼吸內科,海南 三亞572000)

腫瘤微環境是指腫瘤發生、發展、轉移等過程中腫瘤細胞所處的內外環境,主要包括腫瘤細胞、腫瘤局部浸潤的免疫細胞、活性介質、間質細胞共同構成的局部內環境［1］,其中作為局部浸潤的免疫細胞中最主要的免疫細胞——腫瘤相關巨噬細胞參與腫瘤轉移和侵襲、免疫調節、血管和淋巴管形成,在腫瘤發生發展過程中起著至關重要的作用［2-3］。在胃癌組織中發現大量腫瘤相關巨噬細胞浸潤,而且胃癌大小、淋巴結轉移、TNM 分期與其有關［4］；臨床數據顯示,其大量浸潤是造成乳腺癌預后不良的主要原因［5］,可通過分泌多種細胞因子及趨化因子來降低放療、化療的敏感性,促進乳腺癌侵襲、浸潤和轉移,還可促進相關血管生成［6］,目前已將其作為多種腫瘤治療靶點及潛在預后指標。

小檗堿也稱為黃連素,是從黃連中分離得到的主要有效成分,用于治療腸道細菌感染引起的腹瀉［7］,它除了具有抗炎、抗微生物等作用外,還可用于抗腫瘤,其機制大多為抑制腫瘤細胞增殖和轉移、造成腫瘤細胞代謝功能紊亂、誘導腫瘤細胞凋亡等［8-9］,在多種腫瘤中影響相關巨噬細胞極化［10-12］,但其是否通過免疫調節腫瘤相關巨噬細胞來最終發揮抑制腫瘤發生發展目前尚無報道。研究證實,腫瘤相關巨噬細胞和腫瘤微環境與肺癌發生、發展、轉移等多種生物學特性密切相關［13］,故本實驗通過THP-1 細胞誘導M2 型腫瘤相關巨噬細胞,研究小檗堿對與其共培養肺癌A549 細胞增殖、遷移和侵襲的影響,以期為該成分在肺癌臨床治療中提供實驗依據。

1 材料

小檗堿(批號110715-200911) 購于中國食品藥品檢定研究院,含有量99%。人肺癌A549 細胞株、人急性單核細胞白血病細胞THP-1 均購于中國科學院上海生命科學院細胞庫。二甲基亞砜(批號S16065)、Matrigel 膠購于美國Sigma 公司；RPMI 1640 培養基(批號20150714)、胰蛋白酶(批號25200-78)、胎牛血清(批號20150618) 購于美國Gibco 公司；青霉素、鏈霉素購于賽默飛世爾生物化學制品有限公司； Trizol 試劑 (批號16827454) 購于美國Invitrogen 公司；MTT 檢測試劑盒(批號140705) 購于碧云天生物技術有限公司；ELISA 檢測試劑盒(批號D710323-0048)、實驗所用引物均購于或合成于上海生工生物工程有限公司； BCA 蛋白定量試劑盒 (批號D9109B)、ECL 發光檢測試劑盒(批號IH0028) 購于大連寶生物工程有限公司； 逆轉錄試劑盒 (批號RR048A)、RT-PCR 試劑盒(批號RR421A) 購于日本TaKaRa 公司；IL-10 抗體、TGF-β 抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購于美國Novus Biologicals 公司； Transwell 小室 (孔徑8.0 μm, 直徑6.5 mm) 購于美國Corning 公司。

2 方法

2.1 細胞增殖檢測 采用MTT 法。將處于對數生長期的THP-1 細胞以5×103/孔密度接種于96 孔細胞培養板中,置于37 ℃培養箱中培養12 h,分別用0、5、10、20、50 μmol/L 小檗堿處理,每組設置3 個平行復孔,分別處理24、48、72 h 后,每孔細胞中添加5 mg/mL MTT 溶液20 μL, 置于37 ℃培養箱中繼續孵育4 h,棄去上清液,再向每孔細胞中添加100 μL 二甲基亞砜,避光充分振蕩混勻,待沉淀完全溶解后, 酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處檢測光密度值(OD 值),計算細胞增殖率,公式為增殖率＝ (實驗組OD 值/對照組OD 值) ×100%。

2.2 細胞誘導和分組 參照文獻［14］,將處于對數生長期的THP-1 細胞以3×105/孔密度接種于6 孔板中,將細胞分為3 組：對照組細胞直接加入終濃度100 nmol/L 的PMA 處理72 h,THP-1 細胞轉化為巨噬細胞； 模型組細胞在加入終濃度100 nmol/L PMA 處 理 6 h 后, 加 入 終 濃 度20 ng/mL IL-4 繼續誘導66 h,此時THP1 細胞轉化為2 型巨噬細胞； 小檗堿組先加入終濃度20 μmol/L小檗堿預處理1 h 后,再加入終濃度100 nmol/L PMA 處理6 h, 最后加入終濃度20 ng/mL IL-4 誘導66 h。各組細胞經PBS 洗滌后,不同激活狀態的巨噬細胞更換1 mL 無血清RPMI 1640 培養基培養24 h 后,收集上清液和細胞。

2.3 CD206、IL-10、TGF-β 表達檢測 采用RTPCR 法。各組細胞以Trizol 法提取總RNA,紫外分光光度計檢測濃度和純度后,選取兩者都達到要求的RNA,采用逆轉錄試劑盒合成cDNA,將其質量濃度調整為50 ng/μL,RT-PCR 試劑盒進行檢測,實時熒光定量PCR 儀檢測目標基因。反應條件為94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,40 個循環,最后72 ℃終延伸10 min。以β-actin 為內標,以相對定量2-△△Ct檢測細胞中CD206、IL-10、TGF-β 表達。

2.4 IL-10、TGF-β 表達檢測 采用Western blot法。各組細胞中加入蛋白裂解液, 置冰上裂解30 min后提取蛋白,BCA 試劑盒測定蛋白濃度,取120 μg,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,半干法轉移凝膠上的蛋白至PVDF 膜上,于5%小牛血清封閉液中封閉4 h,分別加入IL-10 一抗(1 ∶1 000倍稀釋)、TGF-β(1 ∶1 000 倍稀釋) 進行雜交,搖床上4 ℃孵育過夜,TBS 洗膜后,加入二抗(1 ∶1 500 倍稀釋) 進行雜交,室溫孵育2 h。TBS洗滌后,ECL 化學發光試劑盒進行發光,暗室中曝光拍照,Image J 圖像分析系統分析各條帶灰度值,以β-actin 為內標蛋白,以相對灰度值表示IL-10、TGF-β 蛋白相對表達。

2.5 IL-10 水平檢測 采用ELISA 法。將各組細胞培養上清按照相應ELISA 檢測試劑盒說明書進行操作,分別為一抗工作液進行孵育,洗去未結合成分；二抗工作液進行孵育,洗去未結合成分；發光工作液進行孵育,待孵育完成后需立即終止反應,酶標儀上檢測各孔OD 值,參照標準曲線檢測IL-10 水平。

2.6 共培養對A549 細胞增殖的影響 采用MTT法。將單核細胞THP1 誘導為腫瘤相關巨噬細胞后,收集各組不同激活狀態的巨噬細胞上清液,將其與A549 細胞共培養24、48、72 h 后,檢測對A549 細胞增殖的影響,方法同“2.1” 項。

2.7 細胞侵襲和遷移能力檢測 采用Transwell 實驗。Matrigel 膠以無血清培養基稀釋后,加到Transwell 小室的上室中, 置于37 ℃培養箱中靜置30 min,制備Matrigel 基質膠涂層。將各組細胞用0.25%胰蛋白酶消化,PBS 洗滌后用無血清培養基重懸細胞制成單細胞懸液,將細胞密度調整為2×105/mL,Transwell 上室加入200 μL 細胞懸液,下室加入各組不同激活狀態的巨噬細胞上清液500 μL,37 ℃培養箱中培養24 h,取出Transwell小室,拭去上室細胞及碎片,結晶紫染色,PBS 清洗在倒置顯微鏡下觀察小室濾膜下室附著的細胞,隨機選取5 個視野,計數穿過膜的細胞數,統計細胞侵襲能力。 同法檢測各組細胞遷移能力,Transwell 上室濾膜不經Matrigel 基質膠涂覆,其余步驟同Transwell 侵襲實驗。

2.8 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理,數據以表示,組內比較采用單因素方差分析,組間比較采用SNK-q 檢驗,每組數據代表3 個生物學重復。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小檗堿對THP-1 細胞增殖的影響 圖1 顯示,處理48 h 后0、5、10 μmol/L 小檗堿對THP-1細胞增殖無顯著影響(P＞0.05)；濃度從20 μmol/L開始增加時,細胞增殖率逐漸降低,并隨著作用時間延長呈反比,與對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；濃度為50 μmol/L 時,處理THP-1 細胞24、48、72 h 后細胞增殖率均顯著下降(P ＜0.05),表明有一定毒副作用,故選擇20 μmol/進行后續實驗。

圖1 小檗堿對THP-1 細胞增殖的影響Fig.1 Effect of berberine on THP-1 cell proliferation

3.2 小檗堿對THP-1 細胞轉化為M2 型腫瘤相關巨噬細胞的影響 圖2 顯示,與對照組比較,模型組CD206、 IL-10、 TGF-β 表 達 顯 著 升 高 (P ＜0.05),表明腫瘤相關巨噬細胞誘導成功,而且誘導后的細胞表型為M2 型；與模型組比較,小檗堿組三者表達顯著降低(P＜0.05)。

圖2 小檗堿對THP-1 細胞轉化為M2 型腫瘤相關巨噬細胞的影響Fig.2 Effect of berberine on the conversion of THP-1 cells into M2 tumor-associated macrophages

3.3 小檗堿對A549 細胞增殖的影響 圖3 顯示,模型組上清培養液共培養的A549 細胞在24、48、72 h 的OD 值均顯著高于對照組(P＜0.05),而小檗堿組均顯著低于模型組(P＜0.05)。

圖3 小檗堿對A549 細胞增殖的影響Fig.3 Effect of berberine on A549 cell proliferation

3.4 小檗堿對A549 細胞遷移的影響 圖4 顯示,模型組上清培養液共培養的A549 細胞遷移能力顯著高于對照組(P＜0.05),而小檗堿組顯著低于模型組(P＜0.05)。

3.5 小檗堿對A549 細胞侵襲的影響 圖5 顯示,模型組上清培養液共培養的A549 細胞侵襲能力顯著高于對照組(P＜0.05),而小檗堿組顯著低于模型組(P＜0.05)。

4 討論

肺癌是一種常見的肺部惡性腫瘤,其發病率和死亡率正逐年上升,給人類健康和生命造成嚴重影響,其發病原因目前尚不十分明確,但其增殖、侵襲和轉移惡性生物學特性是導致患者死亡的主要原因,也是治療難點［15］。研究表明,腫瘤微環境與腫瘤細胞能在特定器官發生和轉移緊密相關［16］,它是由大量不同類型細胞構成的局部病理環境,免疫細胞是主要組成,參與抗腫瘤免疫反應的激活,發揮清除腫瘤細胞作用,還可被腫瘤細胞募集,促進免疫細胞的長,在腫瘤行為學特性中發揮舉足輕重的作用［17］。

腫瘤相關巨噬細胞是免疫細胞的成員之一,組織類型、腫瘤類型、腫瘤分期等多項因素影響其異質性,它具有的表型及功能與浸潤到腫瘤組織的部位相關,在腫瘤發展不同階段其表型也不同,慢性炎癥階段大多呈M1 型,浸潤及血管生成階段則大多呈M2 型［18］。其中,M1 型可分泌一些促炎細胞因子、趨化因子；M2 型可分泌多種抗炎分子,如CD206、IL-10、TGF-β 等［19-20］。本實驗發現,由單核細胞THP1 誘導成的腫瘤巨噬細胞CD206、IL-10、TGF-β 表達均上調,表明它們具有M2 分子表型,故將其用于后續實驗。

圖4 小檗堿對A549 細胞遷移的影響Fig.4 Effect of berberine on A549 cell migration

圖5 小檗堿對A549 細胞侵襲的影響Fig.5 Effect of berberine on A549 cell invasion

小檗堿具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性,但其作用機制目前尚不清楚。體內實驗中,小鼠灌胃小檗堿后細菌感染存活率明顯升高；體外實驗中,小檗堿處理小鼠巨噬細胞后可增強炎癥小體活化,促進成熟IL-1β 釋放及細胞凋亡,表明該成分可通過增強巨噬細胞抗菌功能來達到抗菌消炎作用；在小鼠皮下移植結腸癌CT26 細胞后用小檗堿治療移植瘤,發現其生長明顯受到抑制,而且CD206、CD68 陽性細胞數顯著增多,表明該成分是通過調節腫瘤相關巨噬細胞形成來抑制腫瘤生長［21］；本實驗發現,與模型組相比小檗堿組M2型巨噬細胞標志物CD206、IL-10、TGF-β 表達明顯降低,表明該成分可抑制巨噬細胞向M2 型轉化。另外,小檗堿可抑制脂多糖、白細胞介素-4誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7 細胞向M2 型極化,在維持M1/M2 動態平衡中發揮作用［22］,與本實驗結果一致；可抑制家族性腺瘤性息肉病(FAP) 動物模型Apc(Min/+) 小鼠腸道息肉的生長,其作用機制與其誘導息肉組織中的腫瘤相關巨噬細胞分化,抑制環氧合酶-2 表達有關［23］；可抑制LPS 誘導巨噬細胞相關炎癥因子的釋放, 抑制JNK、IKKβ 信號通路激活,介導脂肪細胞的糖代謝功能恢復［24］；可抑制子宮內膜癌細胞轉移,抑制細胞分泌IL-8 及與腫瘤巨噬細胞共培養的子宮內膜癌細胞增殖［11］；本實驗通過不同激活狀態的腫瘤相關巨噬細胞培養上清與肺癌A549 細胞共培養,發現小檗堿可抑制A549 細胞增殖、遷移和侵襲,與以上研究一致。

綜上所述,小檗堿可通過作用于腫瘤相關巨噬細胞來抑制肺癌A549 細胞的增殖、侵襲和遷移,可能與其調控腫瘤巨噬細胞表型有關,但它在體內是否發揮同樣作用仍需進一步證實。本實驗可為肺癌治療提供理論依據,也為抗腫瘤機制研究提供新方向。