芪歸益腎方對小鼠腎臟纖維化的延緩作用

尹歸東, 席 一, 魏 祥, 魏明剛*

(1.蘇州大學附屬第一醫院,江蘇 蘇州215006；2.寧鄉市中醫醫院,湖南 長沙410600)

慢性腎臟病病因復雜,病情易反復,其不斷進展的主要原因是腎組織內炎癥因子與抗炎癥相關因子之間的失衡,導致組織內過度炎癥反應及組織損傷,從而引起纖維組織增生,同時腎組織內固有細胞轉分化,如小管上皮細胞向成纖維細胞轉化,分泌過多的細胞外基質,共同促成腎臟纖維化［1］。因此,如何減輕腎臟組織內炎癥反應,阻止腎臟纖維化發生,往往是治療慢性腎臟病的關鍵。

近年來研究表明,血液系統中某些凝血、纖溶相關物質與腎組織內炎癥反應和纖維化有關,如腎血管內皮細胞膜上的凝血酶調節蛋白(TM) 和凝血酶結合可活化蛋白質C(PC),活化的后者與內皮細胞蛋白質C 受體(EPCR) 結合而影響下游信號分子,可減輕腎臟的炎性損傷［2-3］。隨著腎組織內炎癥反應發生,纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1) 在系膜細胞、內皮細胞、小管上皮細胞上表達增加［4］,它可通過抑制基質金屬蛋白酶2、纖溶酶活性來減少細胞外基質的降解,從而引起腎組織中細胞外基質的沉積［5-6］。

本課題組具有自主知識產權的方劑——芪歸益腎方具有健脾益腎、活血通絡的功效,前期基礎與臨床研究中已證實它具有減輕蛋白尿、延緩腎臟纖維化的作用［7-9］。中醫“活血通絡” 與西醫“凝血” “纖溶” 有相通之處,故推測芪歸益腎方可能通過影響凝血、纖溶相關物質來發揮減輕腎組織內炎癥反應、延緩腎臟纖維化的作用,并通過本實驗來驗證這個觀點。

1 材料

1.1 動物 雄性ICR 小鼠40 只,SPF 級,體質量(20±2) g,由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供,實驗動物生產許可證號SYXK(蘇)2017-0043。

1.2 試藥 PAI-1 抗體(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號DK8014)；TGF-β1 抗體(批號AH03071206)、山羊抗大鼠二抗(批號133974)［愛必信(上海) 生物科技有限公司］；Thrombomodulin 抗 體 (美 國 R＆D 公 司, 批 號cakk031805A)；Fibronectin 抗體(武漢博士德生物工程有限公司,批號153188)；山羊抗兔二抗(批號167976)、Tubulin 抗體(批號166453) (杭州聯科生物技術股份有限公司)；鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司,批號x2615)；磷酸川芎嗪片(麗珠集團麗珠制藥廠,批號170901)。芪歸益腎方藥材(黃芪30 g、太子參15 g、芡實30 g、金櫻子30 g、當歸15 g、牛膝15 g、川芎15 g、炒白術15 g、白花蛇舌草30 g、蟬蛻12 g、甘草6 g,批號180218010) 由蘇州天靈藥業有限公司提供,經蘇州大學附屬第一醫院藥學部毛葉勤副主任中藥師鑒定為正品,均符合2015 年版《中國藥典》 相關要求,由蘇州大學附屬第一醫院制劑室經煎煮、濃縮方法制備成混懸液,生藥量1 g/mL。

1.3 儀器 電泳儀、 電泳槽、 轉移槽、 GelDoc XR+全自動凝膠成像系統(美國Bio-Rad 公司)；SpectraMax 190 光吸收酶標儀(美谷分子儀器有限公司)； Axio Imager M1m 顯微鏡 (德國ZEISS公司)。

2 方法

2.1 造模［10］小鼠用2%戊巴比妥麻醉后,進行左側輸尿管阻斷術。小鼠固定于手術臺,腹部消毒,沿腹正中線切開皮膚、肌層,剪開腹膜,暴露左側腎臟、輸尿管,用5/0 絲線結扎輸尿管兩道,逐層縫合關腹,假手術組僅開腹并游離左側輸尿管,但不結扎輸尿管,其余步驟與手術組相同,4 ℃生理鹽水從左心室注入,剪開右心耳流出血液,灌洗體循環血液,快速剖取左腎,一部分以4%多聚甲醛溶液固定,用于組織染色和免疫組織化學檢測；另一部分迅速置于液氮中, 儲存于-80 ℃冰箱,用于Western blot 檢測。

2.2 分組及給藥 將40 只小鼠適應性喂養1 周,自由飲水、 進食, 隨機分為芪歸益腎方組(10 g/kg),貝那普利組(10 mg/kg)、川芎嗪組(100 mg/kg)、模型組(生理鹽水10 mL/kg)、假手術組(生理鹽水10 mL/kg)。造模成功2 d 后,連續灌胃給藥10 d。

2.3 腎組織形態學觀察 小鼠腎組織石蠟切片3 μm,進行HE、Masson 染色,光鏡下觀察,以半定量方法評估腎小管間質纖維化程度。每個標本切片觀察20 個200 倍不重疊視野,以每個視野中腎小管擴張、炎癥細胞浸潤、腎小管萎縮和管型形成、間質細胞外基質沉積范圍占總視野比例計算腎小管間質纖維化指數：0 分,正常；1 分,＜10%；2 分,11%～25%；3 分,26%～50%；4 分,51%～75%；5 分,＞75%。

2.4 免疫組化檢測 小鼠腎組織石蠟切片,常規脫蠟入水,3%H2O2孵育10 min,消除內源性過氧化物酶活性后PBS 洗滌3 次,微波抗原修復,5%牛血清蛋白封閉20 min,PBS 洗滌3 次,加入一抗,4 ℃下孵育過夜(Fibronectin 一抗稀釋比例為1 ∶100, PAI-1 為1 ∶100, TGF-β1 為1 ∶400,Thrombomodulin 為1 ∶100),次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h,PBS 洗滌3 次,DAB 顯色,蒸餾水沖洗,蘇木素復染7 min,鹽酸乙醇分化數秒使細胞核呈紫藍色,加氨水數秒至返藍,蒸餾水沖洗。然后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,樹膠封片,光鏡下棕黃色顆粒區域為陽性表達,每張切片隨機尋找20 個400 倍不重疊視野,Image Pro Plus 6.0 軟件進行分析,以陽性面積/視野總面積表示蛋白表達量。

2.5 Western blot 檢測 取-80 ℃下保存的小鼠腎組織,加入RIPA 裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)并進行組織研磨,提取組織總蛋白后測定其濃度。每孔加40 μg 總蛋白上樣,進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE) 電泳,濕轉法電轉移至硝酸纖維素膜。 加入含5%牛血清白蛋白(BSA) 的TBST 緩沖液,室溫下封閉l h,再加入一抗,4 ℃下孵育過夜(Fibronectin 一抗稀釋比例為1 ∶400,PAI-1 為1 ∶1 000, TGF-β1 為1 ∶1 000,Thrombomodulin 為1 ∶1 000,Tubulin 為1 ∶5 000),洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶2 000),室溫下孵育1 h,洗膜,ECL 試劑曝光顯影。Image Pro Plus 6.0 軟件進行分析,通過目的蛋白與內標Tubulin 的灰度比值計算目的蛋白相對表達量。

2.6 統計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理,符合正態分布的計量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠左側腎臟外觀 芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組、模型組小鼠左側腎臟(結扎腎)體積相比假手術組(未結扎腎) 明顯增大,腎臟包膜緊張呈半透明狀,可見黃色半透明的液體。梗阻側腎臟縱向剖開后,可見血性或者乳白色積液流出,剖面觀可見腎盂明顯擴張,腎皮質明顯變薄。

3.2 小鼠腎組織病理變化 HE 染色顯示,假手術組小鼠腎小球、腎小管及間質正常,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組、模型組都有不同程度腎小管擴張、炎癥細胞浸潤、腎小管管型形成、間質細胞外基質沉積；Masson 染色顯示,小鼠腎臟膠原染色呈藍色,假手術組無藍色染色,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組、模型組都有不同程度的藍色染色,主要位于腎小囊、系膜區和腎小管的毛細血管周圍及腎小管周圍間質部分。模型組小鼠腎小管間質纖維化指數顯著高于芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組(P＜0.05),而芪歸益腎方組又顯著低于貝那普利組、川芎嗪組(P＜0.05)。見圖1。

3.3 免疫組化檢測 與假手術組比較,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組、模型組腎組織中TGF-β1、PAI-1、FN 表達顯著升高 (P ＜0.05),TM 表達顯著降低(P＜0.05)；與模型組比較,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組前三者表達顯著降低 (P ＜0.05), 后者表達顯著升高 (P ＜0.05),以芪歸益腎方組更明顯(P ＜0.05)。見圖2。

圖1 各組小鼠腎組織病理變化（×200）Fig.1 Renal pathological changes of mice in various groups（×200）

3.4 Western blot 檢測 與假手術組比較,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組、模型組腎組織中FN、TGF-β1、PAI-1 表達顯著增加 (P ＜0.05),TM 表達顯著降低(P＜0.05)；與模型組比較,芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組前三者表達顯著降低 (P ＜0.05), 后者表達顯著升高 (P ＜0.05),以芪歸益腎方組更明顯(P ＜0.05)。見圖3。

4 討論

在慢性腎臟病的發生發展過程中,血液高凝狀態發揮了重要負面作用,這一點已形成共識［11］。近年來還發現,一些凝血、纖溶相關物質通過激活信號通路來影響腎組織內炎癥狀態,并參與腎臟纖維化過程。

凝血酶調節蛋白(TM) 主要存在于血管內皮表面,同時也存在于胸腔膜、心包膜、腹腔膜、蛛網膜等組織的間皮細胞表面,它是一種跨膜糖蛋白,由5 個結構域組成,復雜結構使其具有多種生理功能。凝血酶能激活蛋白質C(PC),而TM 能使激活速度增加1 000 倍,活化的PC 能滅活Ⅴ因子和Ⅷ因子,減少腎血管內微血栓形成的風險,從而逆轉凝血酶,還可與內皮細胞蛋白質C 受體(EPCR) 結合,通過影響下游信號分子來減輕腎臟炎性損傷［2-3］； 也可激活蛋白酶激活受體1(PAR1) 而誘導下游信號通路,從而發揮促炎作用［12］,并且調節蛋白和凝血酶結合時可阻止后者對PAR1 的激活,發揮抗炎作用［13］。

圖2 各組FN、TGF-β1、PAI-1、TM 表達（免疫組化，×400）Fig.2 Expressions of FN，TGF-β1，PAI-1 and TM in various groups（immunohistochemistry，×400）

腎臟是一個容易受到缺血性損傷的器官,因為人在應急狀態下為保障心、腦重要器官的血液供應而發生交感神經興奮,對各器官血液供應重新調配,腎臟供血急劇減少,并且慢性腎臟病在損傷修復的過程中,間質中膠原纖維沉積增加,毛細血管數減少,故對缺血性損傷非常敏感［14］,而且組織內缺氧及高壓力、高灌注造成對內皮細胞的高切應力,均會造成內皮細胞損傷。受損的血管內皮細胞合成內皮素增加,而合成NO 減少,這種縮血管物質與舒血管物質之間的失衡導致微血管過度收縮,又進一步加重缺血性損傷,當內皮細胞損傷時,TM 細胞外區域裂解為可溶性片段,Bao 等［15］發現,在慢性腎臟病患者血漿中TM 裂解產物濃度明顯升高,并且與病情嚴重程度呈正相關。川芎有效成分川芎嗪、黃芪有效成分黃芪黃酮和黃芪多糖、川芎和當歸有效成分阿魏酸都已證實具有內皮細胞保護作用［16-19］,本實驗發現,芪歸益腎方組腎組織中TM 表達明顯低于假手術組,可能是輸尿管結扎造成梗阻后組織水腫造成腎內血管受壓迫,引起缺血性損傷,腎組織內炎癥反應加劇,造成血管內皮受損,TM 裂解增加；較貝那普利組、川芎嗪組更能明顯增加TM 在腎組織中表達,可能是該方能更好地保護內皮細胞,有利于增加TM 表達或保護其免受裂解,從而減輕腎組織內炎癥反應。

圖3 各組FN、TGF-β1、PAI-1、TM 表達比較（Western blot）Fig.3 Expressions of FN，TGF-β1，PAI-1 and TM in various groups（Western blot）

纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1) 可與組織型纖溶酶原激活劑(t-PA) 和尿激酶纖溶酶原激活劑(u-PA) 結合并使其滅活,tPA 主要由內皮細胞合成,而u-PA 由內皮細胞、巨噬細胞、腎臟上皮細胞、某些腫瘤細胞合成,兩者均可激活纖溶酶原,使其轉變為纖溶酶,故PAI-1 間接抑制了纖溶酶原激活,它主要由血管內皮細胞和肝細胞合成,血小板中也可合成,在正常的小鼠、大鼠、人腎臟組織中PAI-1 表達很少,但隨著炎癥反應發生,其在內皮細胞、系膜細胞、小管上皮細胞中表達增加［4］。Oda 等通過UUO 模型發現,PAI-1 基因敲除小鼠相比野生型小鼠腎間質纖維化明顯減輕［20］；Zhang 等［21］報道,利用PAI-1 突變體抑制內源性PAI-1 活性有利于延緩糖尿病腎病發生,并有足細胞保護作用；杜義斌等［22］利用PAI-1 基因敲除小鼠發現,PAI-1 可通過抑制纖溶酶、基質金屬蛋白酶2 活性,減少細胞外基質的降解,從而引起小鼠腎臟中細胞外基質的沉積［5］；Song 等［23］通過動物實驗證實,具有健脾益腎,活血泄濁功效的中藥制劑可通過抑制TGF-β1、PAI-1 表達,從而抑制細胞外基質過度積聚,減輕腎臟纖維化程度,其中前者是腎臟纖維化最核心的調節因子,可通過上調后者表達來促進細胞外基質聚積；本實驗也證實,TGF-β、PAI-1 表達具有一致性, 并且通過Western blot、免疫組化檢測發現,假手術組后者表達很少,而模型組、芪歸益腎方組、貝那普利組、川芎嗪組都有不同程度升高,可能是輸尿管結扎造成梗阻后,隨著腎組織內炎癥反應加劇前者表達增加,使得后者表達也增加, 以芪歸益腎方組更明顯。

中醫認為,慢性腎臟病導致的腎臟纖維化屬“腎絡癥瘕”,其病機為本虛標實,因虛致實,即脾腎兩虛,血脈瘀阻［24］,治療時健脾益腎固然是關鍵,但活血通絡同樣重要,國醫大師張大寧提出補腎活血法則,在慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病治療中取得了良好療效［25-26］。芪歸益腎方中金櫻子、芡實益腎健脾,為君藥；太子參、黃芪、白術益氣健脾,為臣藥；川芎、當歸、牛膝活血通絡,白花蛇舌草清利下焦,蟬蛻搜風通絡,共為佐藥；牛膝益腎通絡又引藥入腎經,甘草調和諸藥,同為使藥,全方共奏健脾益腎、活血通絡的功效,針對慢性腎臟病的治療既全面又有重點,具有良好的減輕蛋白尿、延緩腎臟纖維化作用。本實驗發現,芪歸益腎方可通過增加腎臟組織中TM 表達或減少其代謝和減少PAI-1 表達,從而起到減輕腎組織內的炎癥反應和纖維化的作用,明確該方可通過影響凝血、纖溶相關因子起到保護腎臟的作用。

腎素-血管緊張素系統的激活在腎臟纖維化過程中發揮重要作用,如血管緊張素Ⅱ通過上調NFκB、TGF-β1、結締組織生長因子(CTGF) 表達,促進腎臟炎癥和纖維化發生［27-28］,同時血管緊張素轉換酶抑制劑能明顯減輕腎臟纖維化［29］,本實驗發現,芪歸益腎方上述效果優于西藥血管緊張素轉換酶抑制劑——貝那普利。川芎嗪是從川芎中提取出的有效成分,具有降低血液黏度、改善微循環、抑制血小板聚集和血栓素A2 合成的作用,并可抑制自由基產生,提高內源性抗氧化酶活性,還有抑制血管平滑肌細胞和成纖維細胞增生,抑制腎臟纖維化的作用［30-32］,本研究發現,芪歸益腎方上述效果優于川芎嗪。課題組前期基礎研究中報道,芪歸益腎方可通過對TGF-β1/Smads/PI3K 信號通路的影響來起到減輕腎臟纖維化的作用［7］,這也證明中藥方劑作為多物質組成的集團具有多靶點治療作用,也是中醫藥治療腎臟病的優勢,對將來中藥方劑的相關研究非常重要。