六味葛藍降脂片HPLC 指紋圖譜建立及5 種成分測定

周雅琪, 蔣 林, 魏博偉, 李曉梅, 李芳嬋, 隨家寧, 郭勇秀

(廣西中醫藥大學藥學院,廣西 南寧530001)

高脂血癥為臨床上的多發病及常見病,是引發脂肪肝、心腦血管疾病的重要病因之一［1］,中醫藥在防治該疾病上具有獨特優勢,可多靶點、多環節綜合降脂,而且毒副作用小,相關中藥或保健食品市場前景良好［2-8］。

六味葛藍降脂片是由廣西中醫藥大學制藥廠擬開發的具有輔助降血脂功效的保健食品,由絞股藍、火麻仁、決明子、葛根、沙棘、荷葉6 味藥食兩用藥材配伍而成,通過扶正祛邪、補中益氣來調節機體代謝機能,從而達到降血脂作用［9-10］。方中葛根和決明子發揮主要作用,前者所含異黃酮是重要藥效物質［11］,葛根素、大豆苷、大豆苷元等［12］具有擴張冠狀動脈血管、增加冠狀動脈血流量作用,同時可降血脂［13-14］；后者具有降血脂、降血壓等療效,可抑制血清膽固醇,以降血脂效果更顯著［15-16］,其主要有效成分為蒽醌［17］,代表性成分有橙黃決明素、大黃酚,為瀉下、降血脂作用的主要成分［18-19］。

本實驗建立六味葛藍降脂片HPLC 指紋圖譜,并測定其中葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚的含有量,為完善該制劑質量標準提供依據。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀,配置UV 型紫外檢測器；TGL-16G 離心機(上海安亭科學儀器廠)；KQ5200B 超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SQP 電子天平［百萬分之一,賽多利斯科學儀器(北京) 有限公司］；超純水(密思博超純水機制備)。 六味葛藍降脂片共10 批(批號20170501、20170601、20170602、20170603、20170701、20170801、 20170802、 20170803、 20170901、20171001),2 g/片,由廣西中醫藥大學制藥廠提供,原藥材均購自廣西玉林市祥生中藥飲片有限責任公司,經廣西中醫藥大學制藥廠質量保證部專家鑒定為正品。葛根素對照品(170109,含有量＞98%,上海融禾醫藥科技有限公司)； 大豆苷(MUST-17092780, 含 有 量99.46%)、 大 豆 苷 元(MUST-17101202,含有量99.99%)、橙黃決明素(111900-201303, 含 有 量 99.1%)、 大 黃 酚(MUST-17041310,含有量99.50%) 對照品 (成都曼思特生物科技有限公司)。乙腈為色譜純(美國Fisher 公司)；甲醇、磷酸為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0 ～8 min,15%A；8 ～20 min,30%A；20 ～40 min,55%A；40 ～45 min,60%A；45～55 min,70%A；55 ～60 min,85%A)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚對照品適量,甲醇分別制成1.210 0、0.750 0、0.635 0、0.570 0、0.315 0 mg/mL,取適量置于同一量瓶中,甲醇稀釋,即得 (質量濃度分別為0.164 1、0.067 3、0.034 4、0.054 9、0.028 9 mg/mL),置于冰箱中貯存備用。

2.2.2 供試品溶液 取本品20 片,研細,精密稱取約2 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入20 mL 甲醇,稱定質量,超聲(200 W、40 kHz) 30 min,冷卻至室溫,甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,續濾液離心,取上清液,即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 取供試品溶液 (批號20170501),在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6次,以7 號峰的保留時間和色譜峰面積為參照,測得其余11 個共有峰的相對保留時間RSD 在0.05%～0.24%之間,相對峰面積RSD 在0.89%～2.0%之間,表明儀器精密度良好,符合相關要求和規定。

2.3.2 穩定性試驗 取供試品溶液 (批號20170501),于0、2、4、8、12、24 h 在 “2.1”項色譜條件下進樣測定,以7 號峰保留時間和色譜峰面積為參照,測得其余11 個共有峰的相對保留時間RSD 在0.09%～1.1%之間,相對峰面積RSD在0.64%～2.0%之間,表明溶液在24 h 內穩定性良好,符合相關要求和規定。

2.3.3 重復性試驗 取本品(批號20170501) 約2 g,按“2.2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,以7 號峰保留時間和色譜峰面積為參照,測得其余11 個共有峰的相對保留時間RSD 在0.10%～0.34%之間,相對峰面積RSD 在1.2%～1.9%之間,表明該方法重復性良好,符合相關要求和規定。

2.3.4 建立方法 取10 批樣品,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,見圖1,再通過“中藥指紋圖譜相似度評價軟件” (2012.130723 版) 進行分析,平均數法生成對照圖譜,多點校正法建立指紋圖譜,見圖2。共標示出12 個共有峰,由于7 號峰(大豆苷元) 保留時間適中,穩定性好,峰面積較大,故選擇其作為參照峰(S)；10 批樣品相似度均大于0.997,表明其質量相對穩定,共有成分基本一致,但含有量上有差異。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

圖2 共有峰HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of common peaks

2.3.5 主要特征峰歸屬 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,記錄色譜圖。結果,共指認出5 個特征峰(2、4、7、8、12 號),分別為葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚。

2.4 5 種成分含有量測定

2.4.1 系統適用性試驗 取對照品、供試品、陰性對照溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖3。由圖可知,對照品、供試品在相同保留時間處都有特征色譜峰, 而陰性對照未發現,拖尾因子均在0.95 ～1.05 之間,表明其他成分對測定無干擾, 理論塔板數以大豆苷元計為6 800。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液,甲醇稀釋,制得含葛根素0.065 7、0.131 3、0.016 41、0.197 0、0.229 8、0.262 6 mg/mL,大豆苷0.026 9、0.053 8、0.067 3、0.080 7、0.094 2、0.107 6 mg/mL, 大 豆 苷 元0.013 8、 0.027 5、0.034 4、 0.041 3、 0.048 2、 0.010 76 mg/mL,橙黃決明素0.022 0、0.043 9、0.054 9、0.065 9、0.076 9、0.087 9 mg/mL,大黃酚0.011 6、0.023 2、0.028 9、0.034 7、0.040 5、0.046 3 mg/mL 的對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標 (X),峰面積為縱坐標(Y) 進行回歸,結果見表1,可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗 取“2.2.1” 項下對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次,測得葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚峰面積RSD 分別為1.7%、1.6%、1.6%、1.7%、1.6%,表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取本品(批號20170501) 適量,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、 大黃酚峰面積RSD 分別為1.3%、 1.1%、1.9%、1.9%、2.0%,表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.5 重復性試驗 精密稱取本品 (批號20170501)6 份,每份2.0 g,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚含有量RSD 分別為0.61%、1.4%、1.6%、1.6%、1.0%,表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取本品(批號20170501) 約1.0 g(葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚平均含有量分別為1.788 5、0.616 9、0.379 6、0.603 3、0.158 4 mg/g),共6份,分別精密加入葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、 大黃酚對照品1.800 0、0.620 0、0.380 0、0.600 0、0.160 0 mg,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,計算回收率。結果,葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚平均加樣回收率分別為 98.1%、 102.6%、 98.0%、 96.0%、 97.7%,RSD 分別為0.72%、1.1%、1.7%、0.54%、0.72%。

2.4.7 樣品含有量測定 精密稱取10 批片劑,每批約2 g,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,計算含有量,結果見表2。

表2 各成分含有量測定結果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of content determination of various consti-tuents（mg/g，n=2）

3 討論

本實驗考察供試品溶液制備方法時,以甲醇、水、乙醇為提取溶劑,比較了超聲、回流提取,以及提取時間、溶劑用量、提取次數對含有量測定的影響,發現在取樣量2 g、甲醇20 mL、超聲30 min條件下供試品溶液中5 種成分總含有量較高,分離度較好,而且操作簡便。然后,采用二極管陣列檢測器分析不同波長下色譜圖,發現在280 nm處各成分較穩定,含有量較高,并與其他雜質峰達到良好的分離效果。

指紋圖譜是一種具有整體性、模糊性、專屬性等特點的質量控制和評價方法［20］,能全面呈現樣品復雜性,近年來廣泛應用于中藥研究中［21］。本實驗發現,10 批六味葛藍降脂片HPLC 指紋圖譜相似度均大于0.9,具有很好的一致性。另外,中藥材有著多成分、多功效的特點,只對其單一成分或特征性成分進行研究無法全面控制其質量［22-24］,故本實驗采用HPLC 法同時測定六味葛藍降脂片中葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚含有量,發現其均存在一定差異,可能是由于藥材種植、地域等因素所致。因此,控制藥材源頭、規范生產工藝是保證保健食品質量穩定的重要措施。

4 結論

本實驗建立六味葛藍降脂片HPLC 指紋圖譜,并測定其中葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚的含有量,該方法簡便、快速、準確,重復性好,專屬性強,既考察了該制劑中多種有效成分的含有量,又通過指紋圖譜整體相似度為其全面質量評價提供可靠依據。