一測多評法同時測定蘇黃止咳膠囊中7 種成分

王加良, 張艷麗, 范景輝, 李海燕

(牡丹江醫學院附屬紅旗醫院,黑龍江 牡丹江157011)

蘇黃止咳膠囊是由牛蒡子、紫蘇葉、紫蘇子、前胡、五味子、麻黃、地龍、蜜枇杷葉、蟬蛻等中藥材加工而成的中成藥復方制劑,收載于國家食品藥品監督管理局標準(YBZ00172008) 中［1］,方中紫蘇葉、麻黃止咳平喘,疏風宣肺,為君藥；五味子、蟬蛻止咳化痰,收斂肺氣,為臣藥；紫蘇子、枇杷葉、地龍、前胡止咳化痰,利咽,牛蒡子利咽止癢,為佐藥。但蘇黃止咳膠囊現行質量標準僅對其所含的鹽酸麻黃堿進行定量檢測,而姚琴等［2］采用HPLC 法測定其中紫蘇醛含有量,尚無多成分同時測定的報道。

中成藥復方制劑組成復雜,單一成分定量測定難以全面控制其質量和療效一致性,多指標成分測定已成為相關質量評價的發展趨勢。蘇黃止咳膠囊中君藥紫蘇葉和紫蘇子主要含有黃酮、迷迭香酸、咖啡酸、阿魏酸等成分,以迷迭香酸為主；臣藥五味子主要含有木脂素、萜類、多糖、有機酸等成分,以五味子醇甲、五味子醇乙等木脂素為主；佐藥牛蒡子主要含有牛蒡苷、牛蒡苷元等木脂素,前胡主要含有白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素等香豆素。為全面有效地控制該制劑質量,本實驗采用一測多評法,以迷迭香酸為內標,建立該成分與牛蒡子苷、牛蒡子苷元、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲的相對校正因子,并計算各成分含有量,以期為其質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司)；AL204 型電子天平［梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司］；SK5200H 型超聲波清洗器(上海科導儀器有限公司)。

1.2 試藥 白花前胡甲素(111711-201703,含有量98.8%)、迷迭香酸 (111871-201706, 含有量90.5%)、白花前胡乙素(111904-201203,含有量98.0%)、五味子醇甲 (110857-201714, 含有量99.9%) 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；牛蒡子苷(20362-31-6)、牛蒡子苷元 (7770-78-7)、白花前胡E 素(78478-28-1) 對照品均購自上海純優生物科技有限公司。蘇黃止咳膠囊(每粒裝0.45 g,批號17120812、18040311、18042111)購自揚子江藥業集團北京海燕藥業有限公司。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相甲醇-0.1%冰醋酸,梯度洗脫［3-6］(0 ～9.0 min,45.0%A；9.0 ～19.0 min,45.0%→52.0%A； 19.0 ～26.0 min, 52.0%→59.0%A； 26.0 ～38.0 min, 59.0%→72.0%A；38.0 ～44.0 min, 72.0% →78.0% A； 44.0 ～50.0 min,78.0%→45.0%A)；0 ～19.0 min 時在280 nm［6-9］波長下檢測牛蒡子苷和牛蒡子苷元,19.0～38.0 min 時在321 nm［7,10-12］波長下檢測迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素,38.0～50.0 min 時在250 nm［7,13］波長下檢測五味子醇甲；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲對照品適量,甲醇分別制成 1.918、 0.882、 0.526、 0.994、 0.266、 0.372、0.418 mg/mL,各精密吸取2.5 mL于同一50 mL 量瓶中,甲醇定容,即得(質量濃度分別為95.9、44.1、26.3、49.7、13.3、18.6、20.9 μg/mL)。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊適量,傾出內容物研細,精密稱取0.2 g,置于50 mL 量瓶中,加45 mL甲醇超聲提取0.5 h,放冷,甲醇稀釋至刻度,振搖均勻,濾過,即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按膠囊處方和生產工藝要求,分別制備不含牛蒡子、紫蘇葉和紫蘇子、前胡、五味子的陰性樣品,按“2.2.2” 項下方法制備,即得。

2.2.4 線標溶液 精密吸取“2.2.1” 項下貯備液各2.5 mL,置于同一20 mL 量瓶中,甲醇制成線標溶液Ⅰ,精密吸取適量,甲醇分別稀釋2、5、10、20、25 倍,分別制成線標溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ,即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性與專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖1。由圖可知,各成分均能實現基線分離,陰性無干擾,理論塔板數按所測成分計均大于3 500,分離度均大于1.5。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.4” 項下線標溶液Ⅰ～Ⅵ適量,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y) 進行回歸,結果見表1,可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.1” 項下對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次,測得牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲峰面 積 RSD 分 別 為 0.57%、 0.68%、 0.71%、0.63%、1.01%、0.96%、0.87%,表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批膠囊 (批號17120812),按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液6 份,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲含有 量 RSD 分 別 為 0.96%、 1.08%、 0.79%、1.05%、1.59%、1.47%、1.43%,表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(批號17120812),于0、2、4、8、16、24 h 在 “2.1”項色譜條件下進樣測定,測得牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、 五味子醇甲峰面積RSD 分別為0.55%、0.62%、0.73%、0.59%、1.04%、0.92%、0.81%,表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取含有量已知的同一批膠囊(批號17120812) 適量,傾出內容物,研細,精密稱取6 份,每份0.1 g,置于50 mL 量瓶中,分別精密加入牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲對照品溶液(質量濃度分別為1.327、0.569、0.718、0.751、0.342、0.479、0.611 mg/mL)2.0、 2.0、 1.0、 2.0、 1.0、 1.0、 1.0 mL, 按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,計算含有量。結果,牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲平均加樣回 收 率 (RSD) 分 別 為 100.1% (0.76%)、99.28% (0.94%)、 97.90% (1.33%)、 99.74%(0.61%)、96.91% (1.40%)、98.56%(1.25%)、98.69% (1.16%)。

2.4 相對校正因子計算 精密吸取“2.2.4” 項下線標溶液Ⅰ～Ⅵ適量,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,以迷迭香酸為內標,計算其他6 種成分相對校正因子f內標/其他成分, 公式為f內標/其他成分＝f內標/f其他成分＝ (W內標×A其他成分) / (W其他成分×A內標) (W為質量濃度,A 為峰面積),結果見表2。

表2 各成分相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性試驗 考察Waters 2695、Agilent 1260色譜 儀 和Kromasil C18、 Shim-pack C18、 Hypersil ODS C18色譜柱對相對校正因子的影響,結果見表3,可知均無明顯影響。

2.6 色譜峰定位 考察“2.5” 項下儀器和色譜柱對相對保留時間的影響,結果見表4,可知均無明顯影響。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

表4 各成分相對保留值Tab.4 Relative retention values of various constituents

2.7 樣品含有量測定 取3 批膠囊,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,分別采用外標法和一測多評法計算含有量,結果見表5,可知2 種方法所得結果為明顯差異。

表5 各成分含有量測定結果（mg/g）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3 討論與結論

本實驗在探索蘇黃止咳膠囊供試品溶液制備方法 時, 分 別 對 提 取 溶 劑 (甲 醇［6-8,13］、 50%甲醇［14］、75%乙醇)、 提取方式 (超聲提取［6-11,13］、回流提取［6］)、提取時間(20、30、40 min) 進行考察,以各成分提取率為指標。最終確定,供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min。

本實驗建立一測多評法同時測定蘇黃止咳膠囊中迷迭香酸、五味子醇甲、牛蒡子苷、牛蒡子苷元、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素的含有量,該方法簡便準確,重復性好,可有效降低檢驗成本,為該制劑質量標準建立和控制提供有力的數據支持。