魚腥草揮發油聚合物膠束的制備

張壯麗, 王紀芬, 汪婉瑩, 趙志鴻, 王桂芳, 鄒 敏

［1.河南省(鄭州大學) 醫藥科學研究院,河南 鄭州450052；2.鄭州大學藥物研究院,河南 鄭州450001］

魚腥草含有多種活性成分,以揮發油、黃酮為主［1-6］,具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗過敏、增強機體免疫力、平喘等功效［7］,其揮發油為淡黃色透明液體,難溶于水,易溶于有機溶劑(如乙醇、氯仿等)。雖然關于該成分的研究報道很多,但仍很有必要研發相關制劑以增加其溶解度,掩蓋不良味道［8］。

泊洛沙姆407 由聚氧乙烯 (PEO) 單元(70%) 和聚氧-丙烯(PPO) 嵌段(30%) 組成,具有多功能三嵌段組合物PEO100-PPO65-PEO100,由于其安全性、較長的循環周期、生物兼容性而廣泛用于制備納米粒［8］,更重要的是它具有較小的CMC［9］,膠束可利用疏水性的內殼包裹魚腥草揮發油,而且具有1～100 nm 粒徑,可避免網狀內皮系統吞噬,被動靶向到達腫瘤部位,從而較好地發揮藥效,同時聚合物膠束還可緩慢釋放藥物［10］。因此,本實驗制備魚腥草揮發油聚合物膠束,以期為相關制劑開發提供參考。

1 材料

魚腥草揮發油(自制)。7890A 氣相色譜儀(美國安捷倫公司)；AR1530 分析天平［梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司］；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52AA 旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；WD-2A 藥物穩定檢查儀(北京同德創業科技有限公司)；ZS90 納米粒度電位分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)；JEM 2100 高分辨透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。甲基正壬酮(中國食品藥品檢定研究院)；泊洛沙姆407(德國巴斯夫公司)；正己烷(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 揮發油提取［11］將干燥的藥材全草粉碎成粗粉,然后與蒸餾水以1 ∶10 的比例浸泡10 h,回流10 h,即得。

2.2 GC 條件 HP-5MS 石英毛細管色譜柱；載氣氦氣,尾吹氣氮氣；進樣口溫度280 ℃,氫火焰離子化檢測器溫度 280 ℃； 空氣體積流量450 mL/min,H2體積流量40 mL/min,柱體積流量1 mL/min；進樣量1 μL；分流比20 ∶1；程序升溫：70 ℃保持5 min,5 ℃/min 升至100 ℃,2 ℃/min升至123 ℃并保持3 min,30 ℃/min 升至280 ℃并保持10 min。

2.3 含有量測定 由于魚腥草揮發油中甲基正壬酮含有量較高,性質較穩定,故本實驗以其為含有量測定指標［12］。

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 對照品溶液 精密稱取甲基正壬酮對照品適量,置于25 mL 棕色量瓶中,正己烷溶解并定容至刻度,混勻,封口膜封口,即得,4 ℃下密封保存,臨用前稀釋成所需濃度。

2.3.1.2 供試品溶液 量取揮發油膠束溶液適量,置于錐形瓶中,加5 mL 正己烷超聲提取2 次,第1 次15 min, 第2 次20 min, 轉移到量瓶中,0.45 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.3.2 專屬性考察 制備空白膠束、揮發油膠束溶液,將兩者和對照品溶液 (甲基正壬酮) 在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖1,可知該方法專屬性良好。

2.3.3 精密度試驗 制備350、150、10 μg/mL 對照品溶液,在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,1 d內間隔相同時間進樣5 次,測定日內精密度；5 d內每天在相同時間進樣1 次,測定日間精密度。結果,3 種質量濃度下前者RSD 分別為1.13%、0.84%、2.15%,后者RSD 分別為0.75%、1.30%、1.27%,表明該方法精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 穩定性試驗 量取“2.3.1”項下供試品溶液,2 d 內每個時間段分別間隔0、3.5、4、4、12 h 在“2.2” 項GC 條件下進樣測定,測得RSD 為2.46%,表明溶液在23.5 h 內穩定性良好。

2.3.5 線性關系考察 分別精密移取對照品溶液1 415、1 101、786、235、157、78、31、15 μL 于10 mL 量瓶中,正己烷定容至刻度,稀釋成450、350、 250、 150、 50、 25、 10、 5 μg/mL, 在“2.2” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y) 進行回歸,得方程為Y＝73 176X-101 784(R2＝0.999 9),在4.767 0～449.687 0 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.3.6 檢測限、定量限測定 配制1、3、5、7、9 μg/mL 對照品溶液, 以S/N ＝10 為定量限,S/N＝3 為檢測限, 測得兩者分別為6.689 8、2.867 0 μg/mL。

圖1 甲基正壬酮GC 色譜圖Fig.1 GC chromatograms of 2-undecanone

2.3.7 加樣回收率試驗 供試品溶液中加入相當于揮發油含有量80%、100%、120%的對照品溶液,平行3 份,在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,計算回收率。結果,3 種質量濃度下平均加樣回收率分別為98.60%、101.21%、101.92%,RSD分別為1.76%、2.98%、1.75%。

2.4 聚合物膠束制備 稱取適量泊洛沙姆407 于圓底燒瓶中, 加入10 μL 揮發油, 氯仿溶解,35 ℃下旋蒸除去有機溶劑,一定體積蒸餾水水化,0.45 μm 濾膜過濾除去未被包裹的揮發油,得到有乳光透明的膠束溶液。精密量取適量于小錐形瓶中,加5 mL 正己烷超聲破乳15 min,分液漏斗內靜置分層, 取上層于10 mL 量瓶中, 下層再加5 mL正己烷超聲破乳20 min,取上層于同一量瓶中,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過濾,取濾液,在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,按“2.3.5” 項下回歸方程計算含有量,并測定包封率和載藥量,公式如下。

2.5 Box-Behnken 響應面法

2.5.1 試驗設計 在單因素試驗基礎上,以揮發油與泊洛沙姆407 比例 (A)、 有機溶劑用量(B)、水化體積(C) 為影響因素,包封率(Y)為評價指標,進行3 因素3 水平設計。因素水平見表1,結果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.5.2 方差分析 線性分析,Y＝0.740 5+0.007 1A-0.005 1B+0.082 8,R2＝0.303；線性+雙因子交互作用分析, Y ＝0.740 5+0.007 1A-0.005 1B+0.082 8C-0.062 2AB+0.029 7AC+0.032 7BC,R2＝0.430 6；線性+平方分析,Y ＝0.897 7+0.007 1A-0.005 1B+0.082 8C-0.129 7A2-0.060 2B2-0.104 7C2, R2＝0.864 2； 二 項 式 擬 合, Y ＝0.897 7+0.007 12A-0.005 14B+0.082 76C-0.129 72A2-0.060 20B2-0.104 75C2-0.062 20AB+0.029 70AC+0.032 72BC,R2＝0.991 7。

表2 試驗設計及結果Tab.2 Design and results of tests

由此可知,二項式擬合模型相關系數最大,故選擇其進行后續研究(α ＝0.05),方差分析見表3。由表可知,R2＝99.17%,調整R2＝97.67%,表明該模型可解釋97.67%包封率的變化；除因素A、B 外對包封率均有顯著影響(P＜0.05)；失擬項P ＝0.406＞0.05,表明其他未知因素對實驗干擾小,能較好地模擬實際情況。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.5.3 響應面分析 見圖2。

圖2 各因素響應面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

2.5.4 驗證試驗 由圖2 可知,最優工藝為揮發油與泊洛沙姆407 比例1 ∶3,有機溶劑用量5 mL,水化體積5.4 mL,包封率91.48%。再平行制備3批聚合物膠束, 測得其包封率分別為87.5%、88.7%、85.6%, 平均87.26% (RSD ＝1.79%),載藥量為3.68%,與預測值相當。

2.6 表征

2.6.1 形態 將聚合物膠束溶液滴到銅網上,

2.0 %磷鎢酸染色,自然晾干后透射電鏡(TEM)觀察,結果見圖3。由圖可知,聚合物膠束無粘連,粒徑與馬爾文粒徑儀測定的一致。

2.6.2 粒徑、PDI、Zeta 電位 圖4 顯示,聚合物膠束平均粒徑為35.20 nm,PDI 為0.158,而且分布均勻,有明顯的乳光現象。另外,其Zeta 電位在-7.51 mV 左右,峰寬度為6.88,體系較穩定。

圖3 樣品TEM 圖Fig.3 TEM image for samples

圖4 樣品粒徑圖Fig.4 Particle size diagram for samples

2.6.3 外貌 泊洛沙姆407 直接溶于蒸餾水中,標記為1 號；直接溶解法、薄膜分散法制備聚合物膠束,分別標記為2、3 號。肉眼觀察發現,1 號不存在乳光澄清透明現象,3 號存在明顯乳光現象,并且比2 號更明顯。

2.6.4 體外釋放行為 吸取薄膜分散法、直接溶解法制備的聚合物膠束溶液各5 mL,分別裝入不同的1 000 Da 透析袋內,釋放介質均為含10%無水乙醇的磷酸鹽緩沖液 (總體積30 mL)［13］,37 ℃下120 r/min 搖床振蕩,于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h 各吸取3 mL,并加入新鮮的3 mL 釋放介質,按“2.4” 項下方法測定含有量,計算累積釋放度,結果見圖5。由圖可知,薄膜分散法制備的聚合物膠束更具有緩釋作用,可能是它被包裹在膠束內殼中,而直接溶解法制備的附在載體表面。

2.7 穩定性評價

圖5 樣品體外釋放曲線Fig.5 In vitro release curves for samples

2.7.1 強光照與高溫 按“2.5.4” 項下優化工藝制備1 份聚合物膠束,平均分成3 份,密封于透明西林瓶中,設置光照強度為3 000 lx,藥物穩定性檢查儀排氣扇打開,分別在第0、5、10 天測得包封率為88.6%、63.7%、30.4%。光照實驗結束后再制備1 批,平均分成3 份,密封于透明西林瓶中,放到已調好的藥物穩定性檢查儀中,安裝保溫擋板(溫度設定為60 ℃),分別在第0、5、10 天測得包封率為87.37%、71.82%、60.58%。由此可知,強光照下粒徑、Zeta 電位變化不明顯,但包封率明顯下降,可能與揮發油中甲基正壬酮在該條件下不穩定有關；高溫下聚合物膠束發生粘連,粒徑變大,PDI 先降低后增大,外觀澄清透明,乳光逐漸消失,推測其可能已被破壞。

2.7.2 4 ℃與室溫 制備1 份聚合物膠束,平均分成6 份,室溫下放置；再取6 份,4 ℃下放置,于第0、5、10、30、60、90 天測定包封率、粒徑、PDI。結果, 室溫下包封率分別為 90.34%、89.21%、 85.78%、 78.64%、 75.31%、 61.62%,狀態無明顯變化,粒徑、PDI 也變化不大；4 ℃下在第60 天出現絮狀物,將其超聲溶解后繼續測定,分 別 為 88.91%、 84.74%、 83.28%、 76.65%、72.84%、73.11%,表明2 種條件下包封率降低程度相當,可能與密封性有關。由于4 ℃下聚合物膠束出現不穩定狀態,故它適合在室溫下貯存。

3 討論

本實驗以甲基正壬酮為魚腥草揮發油含有量測定指標,并通過方法學考察發現其精密度、穩定性、加樣回收率均較理想。同時,首次通過Box-Behnken 響應面法優化魚腥草揮發油聚合物膠束制備工藝,驗證試驗中所測包封率與預測值相當。另外,該制劑粒徑均勻,在35 nm 左右,而且分布無粘連。

測定累積釋放度時發現,薄膜分散法制備的魚腥草揮發油聚合物膠束釋放速度較直接溶解法制備的緩慢,72 h 時仍有釋放,表明此時揮發油均勻分布在膠束的疏水性內殼中,從而達到緩釋作用?？疾旆€定性時發現,聚合物膠束包封率在室溫、4 ℃下均有所減少,可能是其密封性不理想所致,但在4 ℃下第60 天出現的絮狀物在室溫下未出現,可能是該條件下不穩定,或與泊洛沙姆407 性質有關。高溫下揮發油揮發性增強,而且泊洛沙姆407易發生粘連；強光照下包封率顯著降低,這是由于甲基正壬酮在該條件下不穩定。

綜上所述,本實驗制備了魚腥草揮發油聚合物膠束,其粒徑小,包封率高,可將揮發油被動靶向到治療部位,而且能明顯增加其溶解度,掩蓋其不良氣味。采用Box-Behnken 響應面法優化制備工藝,可減少實驗時間,降低資源浪費［14］,為后續研究魚腥草揮發油及相關制劑提供依據。