去氫駱駝蓬堿聚乳酸納米粒的制備及其藥動學行為

尚慧杰, 阮曉東, 陳曉峰

(1.鄭州澍青醫學高等專科學校, 河南 鄭州450064； 2.上海雷允上藥業有限公司技術中心,上海201401)

駱駝蓬Peganum harmala L.為蒺藜科駱駝蓬屬多年生草本植物,去氫駱駝蓬堿是其主要活性成分之一,具有提高免疫、輻射防護、抗菌、抗腫瘤、中樞興奮等藥理作用［1-2］,但該成分水溶性很差,生物利用度低下［3］。因此,有必要采用制劑新技術來解決這一問題,推進它在臨床上的應用。

聚乳酸是一種可生物降解的聚合物,體內最終代謝成二氧化碳和水,被美國、德國等國家批準用于藥用和醫用材料。納米給藥系統是指采用高分子材料作為載體制備的膠體微粒,粒徑＜1 000 nm,可增加難溶性藥物溶解度,降低毒副作用,促進藥物吸收,實現被動靶向［4-7］。本實驗制備去氫駱駝蓬堿聚乳酸納米粒,對其體外基本性質進行初步研究,并考察其藥動學行為,為該成分開發利用提供參考。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；AR2140 型電子天平［梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司］； VORTEX-5 型渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；JY92-II 型超聲儀(寧波新知科儀器研究所)；YC-1200 型臺式冷凍干燥機 (北京亞星儀科科技發展有限公司)；Master-sizer 型粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)；MD200-2 型氮氣吹掃儀(杭州奧威儀器有限公司)；。

去氫駱駝蓬堿對照品(批號20170115,南京澤朗醫藥科技有限公司,含有量＞98%)。聚乳酸(分子量15 000,批號2016081715,山東岱罡科技有限公司)；Poloxamer 188(德國巴斯夫公司,含有量＞98%)。 甲醇為色譜純； 其他試劑均為分析純。

SD 大鼠,雌雄兼具,體質量 (300±20) g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,許可證號SCXK(滬)2012-0002。

2 方法與結果

2.1 去氫駱駝蓬堿含有量測定

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相甲醇-0.2%甲酸(55 ∶45)；檢測波長248 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取去氫駱駝蓬堿對照品10.0 mg,置于10 mL 量瓶中,加入適量甲醇超聲溶解,室溫下放置40 min 后甲醇定容,精密量取適量, 甲醇稀釋成20.0、10.0、5.0、0.5、0.05 μg/mL,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以峰面積(Y) 對溶液質量濃度(X) 進行回歸,得方程為Y＝1.212 4X+0.009 3(r＝0.999 9),在0.05～20.0 μg/mL 范圍內呈良好的線性關系。

2.1.3 方法學考察 取0.05、5.0、20.0 μg/mL對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定5 次,測得3 種質量濃度下日內精密度RSD 分別為0.43%、0.19%、0.17%,日間精密度(連續測定5 d, 每天1 次) RSD 分別為0.82%、 0.37%、0.15%。取空白納米粒混懸液或1.0%十二烷基硫酸鈉水溶液1 mL,加入0.5、5.0、20.0 μg/mL 對照品溶液各1 mL,測得去氫駱駝蓬堿平均加樣回收率為99.71%,RSD 小于1.76%。

2.2 聚乳酸納米粒制備 精密稱取去氫駱駝蓬堿20 mg、聚乳酸160 mg,溶于25 mL 丙酮-乙醇等比例混合溶液中,注射器緩慢加到50 mL 含0.25%Poloxamer 188 的水相中,超聲10 min,減壓旋蒸除去有機溶劑,濃縮,離心60 min(25 000 r/min),沉淀物用蒸餾水洗滌后定容至10 mL,以5%甘露醇為凍干保護劑,-70 ℃下預凍48 h,掛入冷凍干燥機中制備,即得,以去氫駱駝蓬堿計,含有量為2.88%。同法制備空白聚乳酸納米粒。

2.3 粒徑、PDI、Zeta 電位測定 取聚乳酸納米粒凍干前混懸液,蒸餾水適當稀釋后放入比色池中,測定粒徑、PDI、Zeta 電位,結果見圖1 ～2。聚乳酸納米粒粒徑分布在100 ～450 nm 之間,平均粒徑為 (195.38±2.02) nm, PDI 為 (0.131±0.034),Zeta 電位為(-19.48±0.36) mV。

圖1 聚乳酸納米粒粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of polylactic acid nanoparticles

圖2 聚乳酸納米粒Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of polylactic acid nanoparticles

2.4 包封率、載藥量測定 取“2.2” 項下聚乳酸納米粒凍干前混懸液1.0 mL,25 000 r/min 離心60 min,取上清液,按“2.1” 項下方法測定去氫駱駝蓬堿含有量(W1)；另取聚乳酸納米粒混懸液1.0 mL,加入約7 mL 甲醇超聲后定容至10 mL,0.22 μm 微孔濾膜過濾,測定去氫駱駝蓬堿總含有量(W0),計算包封率、載藥量,公式分別為包封率＝ ［(W0-W1) /W0］ ×100%、載藥量＝ ［(W0-W1) /Wt］ ×100% (Wt為聚乳酸納米粒總質量),測得兩者分別為 (76.37±1.08)%、 (8.81±0.25)%。

2.5 體外釋藥行為研究 1.0%十二烷基硫酸鈉溶液制備去氫駱駝蓬堿、聚乳酸納米粒凍干粉混懸液(以去氫駱駝蓬堿計,含有量為2 mg)、含2 mg 去氫駱駝蓬堿混懸液各2 mL,置于透析袋中,兩端扎緊,以1.0%十二烷基硫酸鈉水溶液為溶出介質,體積100 mL, 轉速100 r/min, 溫度 (37±1)℃,于0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24 h 各取樣1.0 mL,同時補加1.0 mL空白釋放介質,按“2.1” 項下方法測定藥物含有量,計算各時間點累積釋放度,繪制釋藥曲線,結果見圖3。由圖可知,去氫駱駝蓬堿在2.5 h 內即基本釋放完畢；其聚乳酸納米粒體外釋藥分為2 個階段,在前8 h 內為快速釋藥期,8 h 后則為緩慢釋藥期,24 h 內累積釋放度為82.17%。然后,通過一級模型、Higuchi 模型、Weibull 模型等對釋藥行為進行擬合,發現釋藥過程更符合Weibull 模型(r＝0.985 7)。

圖3 樣品體外釋放曲線Fig.3 In vitro release curves for samples

2.6 藥動學行為研究

2.6.1 對照品、內標溶液制備 取“2.1” 項下0.5 μg/mL 對 照 品 溶 液, 稀 釋 成20.0、 50.0、100.0、250.0、500.0 ng/mL,即得。精密稱取替硝唑10.40 mg,置于10 mL 量瓶中,8 mL 甲醇超聲溶解,冷卻至室溫后甲醇定容至刻度并逐步稀釋,即得(520 ng/mL)。

2.6.2 血漿樣品處理［3,8］精密量取血漿樣品200 μL于離心管中,同時加入20 μL 內標溶液,飽和NaCO3堿化,加入4.0 mL 乙酸乙酯振蕩混勻3 min,10 000 r/min 離心6 min,轉移上清液至另一離心管中,40 ℃氮氣緩慢吹去有機溶劑,殘渣加入200 μL 甲醇溶解,10 000 r/min 離心6 min,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。

2.6.3 專屬性考察 取空白血漿、血漿對照品溶液(20.0 ng/mL)、給藥12 h 后血漿樣品適量,按“2.6.2” 項下方法處理,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖4。由圖可知,空白血漿內源性物質不干擾測定,去氫駱駝蓬堿和內標分離度良好。

圖4 去氫駱駝蓬堿HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of harmine

2.6.4 方法學考察 取“2.6.1” 項下去氫駱駝蓬堿血漿樣品,按“2.6.2” 項下方法處理,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,以去氫駱駝蓬堿與替硝唑峰面積比值(Y) 對去氫駱駝蓬堿質量濃度(X) 進行回歸,得方程為Y ＝0.038 1X+0.010 9(r ＝0.999 0),在20.0 ～500.0 ng/mL 范圍內呈現良好的線性關系。20.0、250.0、500.0 ng/mL 對照品溶液日內精密度RSD 分別為5.09%、3.37%、3.97%,日間精密度(連續測定5 d,每天1 次)RSD 分別為8.82%、 5.17%、 6.44%。 取20.0、250.0、500.0 ng/mL 對照品溶液各200 μL,氮氣吹除有機溶劑后,加入200 μL 空白大鼠血漿,按“2.6.2”項下方法處理,測得3 種質量濃度下平均加樣回收率分別為90.68%、96.06%、102.18%,RSD＜8.52%。于0、1、2、3、4 d 測定去氫駱駝蓬堿血漿樣品,發現在冷凍保存條件下,去氫駱駝蓬堿與內標峰面積比值無顯著變化(P＞0.05)。

2.6.5 給藥方案及樣品采集 取去氫駱駝蓬堿適量,0.5%CMC-Na 溶液配制成20 mg/mL 混懸液；另取聚乳酸納米粒凍干粉適量,蒸餾水配制成同等濃度混懸液,作為灌胃液,備用。取大鼠12 只,實驗室環境中適應1 d,其間禁食不禁水,然后隨機分為2 組,按40 mg/kg 劑量分別灌胃給予去氫駱駝蓬堿、 聚乳酸納米粒混懸液, 于0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 眼眶采血各約0.3 mL, 置于肝素化離心管中,4 000 r/min下離心3 min,小心分取上層血漿,置于另一空白離心管中,-20 ℃冰箱中保存待測。

2.6.6 藥動學行為研究 大鼠灌胃給予去氫駱駝蓬堿及其聚乳酸納米粒混懸液后,測定不同時間點血漿中去氫駱駝蓬堿血藥濃度,繪制血藥濃度-時間曲線,結果見圖5、表1。由此可知,聚乳酸納米粒Tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞顯著高于去氫駱駝蓬堿(P＜0.05,P＜0.01)。

圖5 樣品血藥濃度-時間曲線Fig.5 Plasma concentration-time curves for samples

表1 樣品主要藥動學參數n=6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for sampless，n=6）

表1 樣品主要藥動學參數n=6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for sampless，n=6）

注：與去氫駱駝蓬堿比較,*P＜0.05,**P＜0.01

參數 單位 去氫駱駝蓬堿 聚乳酸納米粒TC mmaaxx ng·m h L-1 22 13..41 38± ±03.0 2.87 4 50 28..03 83± ±09.1 4.0 67***AUC0～t ng·mL-1·h 1 413.78±211.93 3 256.41±379.05**AUC0～∞ ng·mL-1·h 1 504.48±240.86 3 393.65±423.72**

3 討論

本實驗制備的去氫駱駝蓬堿聚乳酸納米粒粒徑較小,分布均勻,可能是由于溶解藥物、載體的丙酮和乙醇可在水相中迅速擴散,易得到較小的粒徑［9-10］；水相中表面活性劑對納米粒具有穩定作用,不易發生粘連,平均粒徑為(195.38±2.02)nm,而凍干后雖增加至(203.28±3.94) nm,但粒徑變化無顯著差異(P＞0.05)。另外,混合溶劑乙醇與丙酮的比例不可過高,以防聚乳酸析出；水相中表面活性劑濃度也不宜太高,防止增溶作用使去氫駱駝蓬堿溶于水相,從而降低包封率、載藥量,經前期預實驗考察,最終選擇0.25%。

處理去氫駱駝蓬堿血漿樣品時,先加入堿性物質NaCO3使待測組分游離出來,再用有機溶劑乙酸乙酯進行萃取,該方法精密度、回收率等均符合2015 年版《中國藥典》 四部9012 項下生物樣品定量分析方法學驗證指導原則的規定。藥動學行為研究結果顯示,聚乳酸納米粒可顯著提高去氫駱駝蓬堿Cmax和AUC0～t,其原因可能是聚乳酸納米技術可明顯增加藥物分散性和比表面積,從而提高與胃腸道黏膜的接觸面積；納米粒易吸附在胃腸道黏膜,有助于藥物充分吸收,同時可在胃腸道具有淋巴結構的派伊爾淋巴集結中聚集,通過M 細胞進入體循環而促進藥物吸收。測定體外釋放度時發現,聚乳酸納米粒釋放速度明顯慢于去氫駱駝蓬堿,但兩者Tmax相差不大,這可能是由于納米粒可在較短時間內經消化道直接吸收進入體循環［11］,主要途徑為消化道上皮細胞直接吸收,或通過派伊爾淋巴集結和上皮細胞吸收,其相對生物利用度是后者的2.30 倍,有助于充分發揮藥理作用［9,12-13］。今后,將進行去氫駱駝蓬堿聚乳酸納米粒的藥效學研究, 以期為進一步研發提供更完整的實驗數據［14］。