單側咀嚼力降低對大鼠髁突軟骨細胞凋亡的影響

程 潔 谷建琦 張 棟 吳永生 袁 軍 胡玉敬

顳下頜關節（temporomandibular joint，TMJ）是頜面部唯一的雙側聯動關節，TMJ 的功能對咀嚼、吞咽、語言及面部表情等都有非常重要的意義。顳下頜關節紊亂綜合征是近年來臨床發病率很高的一類口腔科疾病，其病因機制復雜，與多種因素相關。近年來，顳頜關節紊亂綜合征的發病年齡低齡化趨勢明顯，而發育期咬合關系的異常又是造成TMJ 疾病的重要病因之一，因此研究生長發育期的TMJ 疾病的致病機制有著重要的臨床意義。本實驗選取的3～8 周齡大鼠相當于人類的青春發育期階段。雙側咬合關系不協調，咀嚼力不均衡，都會對顳頜關節造成不良負擔，可能會誘發細胞凋亡反應的啟動。凋亡蛋白caspase-12 和bak 是內質網凋亡通路中的重要因子，但對其在偏側咀嚼引起的髁突軟骨變化中的作用機制的研究未見深入報道。本研究旨在通過大鼠造模單側磨牙缺失而致的單側咀嚼力降低，研究大鼠髁突軟骨細胞中凋亡蛋白caspase-12 和bak 的變化，進一步探討其引起顳頜關節紊亂綜合征的致病機制。

資料和方法

一、材料

1.實驗動物的選擇與分組：使用河北醫科大學動物中心提供的3 周齡雄性SD 大鼠96 只，適應性飼養一周后，隨機分為8 組，實驗組及對照組各4組，每組12 只。

2.動物模型的建立與取材：各實驗組大鼠經10%水合氯醛4mL/kg 腹腔注射麻醉后，固定頭部，行左側上、下頜所有磨牙拔除術，使得大鼠左側因后牙缺失而降低咀嚼力，分別于拔牙后1d，7d，14d，28d，每組取6 只，深度麻醉（1%戊巴比妥1mL/只）下打開胸腔，經主動脈插管，分別灌注生理鹽水（200mL/只）和多聚甲醛（40g/L，400mL/只），取出雙側髁突關節軟骨，于多聚甲醛中固定。另在每組中取動物6 只，麻醉后直接取髁突軟骨凍存于-80℃冰箱中備用。對照組大鼠不做任何處理，與對應實驗組同期處死并取材。

二、方法

1.蘇木精-伊紅染色（HE 染色）：取材組織塊經固定后，常規石蠟包埋，4μm 切片。常規二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，蘇木素染色5 分鐘，自來水沖洗。鹽酸乙醇分化30 秒，自來水浸泡15 分鐘或溫水（約50℃）5 分鐘。置伊紅液2 分鐘。常規脫水，透明，中性樹脂封固。

2.實時定量PCR 檢測：取雙側髁突軟骨，于-80℃保存，用Trizol 提取組織樣本中總RNA。取5μl RNA 用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性。用天根生物科技有限公司的TIANScript RT KIT 進行反轉錄為cDNA，實驗操作按產品說明書進行。設計引物序列進行擴增，β-actin 用作內定參考。PCR 反應程序：95℃ 15min，95℃ 10s，58℃30s，72℃ 30s，循環40 次。分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。引物序列見表1。

用熒光定量PCR 儀，采用2-△△Ct法進行數據的相對定量分析。根據RealTimePCR 原始檢測結果，按照 2-△△Ct相對定量計算公式，即：△△Ct＝[Ct目的基因（實驗組）-CtBeta基因（實驗組）]- [Ct目的基因（對照組）-CtBeta基因（對照組）]。計算出各樣品的目的基因相對定量結果，即其他各個樣品相對于對照樣品目的基因mRNA 轉錄水平的差異。

表1 PCR 引物序列

3.統計方法：采用SPSS 19.0 統計軟件中單因素方差分析法，比較不同時間點實驗組左、右側及對照組髁突軟骨caspase-12 和Bak 的表達情況，比較各實驗組內同側不同時間點的caspase-12 和Bak的表達情況。

結 果

1.形態學觀察（HE 染色）：大鼠髁突軟骨分為纖維層，增殖層，肥大層及鈣化軟骨層。對照組中各層細胞界限清晰，細胞排列整齊（圖1A）。實驗組左側7 天時細胞排列出現紊亂，增殖層與肥大層界限開始模糊（圖1B）。實驗組左側14 天時細胞排列紊亂更加明顯，肥大層與軟骨層細胞排列稀疏，可見胞核固縮（圖1C）。實驗組左側28 天時出現表層纖維斷裂松解，細胞退行性變化，軟骨細胞可見核內空泡性變（圖1D）。

圖1 HE 染色

2.RT-PCR 檢測結果：因對照組髁突軟骨中caspase-12 和Bak 的含量在不同時間點的左右側對比均無統計學差異（P＞0.05），所以分別將不同時間點對照組的左、右側合并為一組。caspase-12 的含量在1d，7d，14d，28d 時實驗組左側＞實驗組右側＞對照組，實驗組左側caspase-12 含量在各時間點均顯著高于對照組（P＜0.05），實驗組右側caspase-12 含量在 1d，7d，14d 顯著高于對照組（P＜0.05）。隨拔牙時間的延長，對照組caspase-12 含量無明顯變化（P＞0.05），實驗組左側caspase-12 含量逐漸升高，在14d，28d 時升高較前一時間點有統計學差異（P＜0.05），而實驗組右側caspase-12 含量逐漸降低，在7d，28d 時降低較前一時間點有統計學差異（P＜0.05）（表2）。Bak 含量變化趨勢與 caspase-12相似，1d，7d，14d，28d 時實驗組左側＞實驗組右側＞對照組，實驗組左側高于對照組非常明顯，各時間點均有統計學意義（P＜0.05），而實驗組右側在1d，7d，14d 時高于對照組（P＜0.05）。隨時間延長，對照組Bak 含量變化無統計學意義（P＞0.05），實驗組左側Bak 含量逐漸升高（P＜0.05），而實驗組右側逐漸降低（P＜0.05），到28d 時與對照組已無顯著性差異（P＞0.05）。（表3）

表2 各組不同時間段的caspase-12 含量

表3 各組不同時間段的Bak 含量

討 論

髁突軟骨屬于繼發性軟骨，是下頜骨的生長發育中心，它既受局部因素的影響，又受生長因素的影響[1]。多數學者認為適當的壓力負荷對于髁突軟骨的生長發育是有積極改建作用的，但其具體的細胞信號傳導機制尚未研究清楚[2]，而不當的壓力負荷會導致髁突軟骨細胞的凋亡反應[3]。

細胞的凋亡途徑主要有三種：①由細胞表面的死亡受體引發的外在途徑；②內在途徑或稱線粒體途徑；③內質網應激所導致的caspase-12 的活化，從而導致凋亡。前兩種途徑研究的較為廣泛[4]，而第三種途徑在單側咀嚼力降低引起髁突軟骨凋亡的機制中的具體機理鮮有報道。內質網是真核細胞重要的細胞器，是細胞內精細的膜系統，是蛋白質合成和運輸的重要場所[5]，它包含鈣調節分子伴侶，腔內含有凋亡蛋白如caspase-12 和Bcl-2 等。鈣調節分子伴侶凋亡蛋白決定了細胞對內質網應激和凋亡的敏感性。內質網的鈣離子濃度與細胞應激反應有級聯關系，促凋亡蛋白Bak 和Bax 主要是通過調控內質網和線粒體的鈣離子濃度而調節細胞凋亡[6]。如果內質網功能紊亂，細胞將最終啟動caspase-12 依賴的細胞凋亡程序。有實驗[7]表明，caspase-12 缺陷鼠能抵抗內質網應激的細胞凋亡，而對其他凋亡途徑仍可引起細胞凋亡，說明caspase-12 與內質網介導的凋亡有關。

咬合力的改變，會對髁突軟骨造成不同力值的機械刺激，從而改變髁突軟骨內細胞增殖和細胞凋亡的平衡關系。Sriram D[8]等通過對下頜骨髁突進行不同力值和頻率的加載，顯示高頻率低量級的刺激會促進髁突軟骨的適應性重建，并出現軟骨內成骨。很多實驗證實，外在應力的改變，如果打破了髁突軟骨環境的平衡，則會導致其病理性改變，引起細胞凋亡程序的啟動[9～11]。

本研究的形態學觀察顯示，拔牙后，實驗組髁突軟骨隨時間推移，逐漸出現了明顯的軟骨退行性變，表現為各細胞分層逐漸模糊，纖維斷裂，軟骨細胞空泡性變等變化，說明實驗組出現了軟骨細胞的凋亡反應。作為內質網凋亡途徑中的關鍵蛋白，caspase-12 的含量在實驗組雙側的各時間點均較對照組高，說明實驗組髁突軟骨因雙側咀嚼力不均衡，導致軟骨出現退化趨勢，而出現了caspase-12 介導的內質網途徑的凋亡反應，這與以往的實驗研究結果一致[12～14]。而實驗組Bak 含量的升高，增加了內質網鈣離子的釋放，激發了胞質中的鈣依賴性蛋白酶，而鈣依賴性蛋白酶進一步剪切并激活了caspase-12，促進凋亡反應的發生。因此，caspase-12和Bak 的升高是相輔相成的。實驗組左側caspase-12 和Bak 的含量隨時間延長表現出逐漸升高的趨勢，而實驗組右側caspase-12 和Bak 的含量隨時間延長而降低，1d 時實驗組左、右側的差別無統計學意義，28d 時實驗組右側與對照組的caspase-12 含量無統計學差異，分析原因，可能有兩點：①拔牙后1d，因拔牙引起的創傷導致炎癥反應的出現，細胞內的代謝平衡被打破，因此實驗組左、右兩側均表現為促凋亡因子的明顯升高，但創口使得大鼠進食量降低，咀嚼減少，雙側的咬合力不均衡對髁突的影響尚未完全表現出來，因而實驗組左、右兩側caspase-12 和Bak 的含量差異無統計學意義。②實驗組左側后牙缺失，導致左側咀嚼力降低，左側的髁突在關節窩內有向前移動的趨勢，因此左側髁突軟骨受壓迫，導致細胞凋亡反應的活躍。而實驗組右側仍有較為穩定的咬合關系，隨著炎癥的好轉，髁突軟骨因收到咀嚼刺激，發生相應的適應性重建，因此促凋亡因子逐漸減少，到28d 時，其caspase-12含量與對照組已無統計學差異。

異常的咬合刺激，隨時間延長，軟骨出現逐漸加重的退化趨勢，軟骨細胞凋亡增加，基質降解代謝增加[15，16]。咀嚼力降低對發育期大鼠髁突軟骨的細胞增殖無顯著性改變，但對細胞凋亡有明顯的促進作用，進而影響髁突的正常發育[17]。Sato R[18]等研究發現軟食組大鼠因咀嚼力降低，髁突的應力刺激減小，導致髁突軟骨中凋亡細胞增加。食物負荷的改變即髁突承受壓力的改變，對于髁突軟骨細胞的反應都具有負荷依賴性和時間依賴性，或產生適應性代謝反應，或引發不可逆的凋亡反應[19]。本實驗研究結果與上述觀點一致，因此，臨床上應對青少年期單側后牙缺失或牙體缺損導致咀嚼力降低予以足夠重視，警惕其造成進一步關節損傷，引發以關節軟骨的破壞與耗損為主要特征的顳下頜關節骨關節病發生。

綜上所述，單側咀嚼力降低導致大鼠髁突軟骨受力異常，引發促凋亡因子caspase-12 和Bak 的含量升高，誘導內質網應激介導的凋亡反應，內質網途徑是髁突軟骨細胞凋亡的主要途徑之一。