通過miR-202與炎性細胞因子調控關系影響慢性牙周炎病理發展

潘 祁 王培娜

牙周炎是一種慢性、非特異性感染性疾病，是口腔兩大類疾病之一，在世界范圍內均有較高患病率[1]。慢性牙周炎是最常見的一類牙周炎，約占牙周炎患者的95%，由長期存在的慢性牙齦炎向深部牙周組織擴展而引起，主要臨床特征有牙齦炎癥、牙周袋形成、臨床附著喪失、牙槽骨吸收，嚴重者可出現牙齒松動、移位，最后導致牙齒缺失。由于附著于牙面的牙菌斑中的微生物所引起牙周支持組織破壞的慢性感染性疾病，細菌積聚于牙齒表面或直接侵入并同時產生大量毒性產物直接破壞牙周組織，或者引發了宿主免疫反應和炎癥反應，間接性地導致了牙周組織的損傷。

細胞因子是一種小的水溶性肽或糖蛋白，基本功能是分子之間的信號傳導。它們由粒細胞、內皮細胞以及其他的一些細胞通過自分泌或旁分泌方式產生。細胞因子的一些亞型是促炎介質如白細胞介素（interleukin，IL）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等，稱為炎性細胞因子，對控制炎癥反應起著十分重要作用。目前認為牙周炎導致牙周組織的破壞主要通過兩種途徑：牙周致病菌及其產物的直接破壞和過度的宿主反應所造成的間接破壞[2～5]。目前認為后一種途徑是造成牙周組織破壞的主要原因。在宿主反應的過程中，一系列炎癥介質包括IL、TNF 等起到了重要作用，它們不僅可以直接導致牙周組織的破壞，還可以進一步影響宿主的炎癥和免疫反應進程，加重牙周組織的破壞。IL 是非常重要的細胞因子家族，它們在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調節等一系列過程中均發揮重要作用，參與免疫應答和介導炎癥反應，與牙周炎有密切的關系。

微小RNA（miRNA）對免疫系統以及炎癥性疾病的調控具有復雜性和網絡性，目前的研究表明miRNA 對不同的細胞、在不同的時空、靶向不同基因的調控作用表現出明顯差異，其機制并未完全澄清[6，7]。因此，深入了解 miRNA 的生物學活性、了解其調控的靶基因以及其精細的調控途徑，為我們研究miRNA 的免疫調控作用提供借鑒和經驗，也有助于探討miR-202 在慢性牙周炎以及其他所有相關疾病防治中的意義。

資料和方法

1.研究對象：選取自2015年5月至 2018年3月于我院口腔科就診的85 例慢性牙周炎患者為慢性牙周炎組，選取本院同期體檢的健康志愿者51 例為對照組，兩組患者基線資料比較均無統計學差異（P＞0.05），見表1。本研究經院倫理委員會批準，患者知情同意。

2.唾液標本采集：唾液標本采集按照Rhodus 改良的方法[8]收集非刺激性全唾液，采集時間為上午9：00～11：00，采集前禁食、水 1 小時，并用蒸餾水漱口1 次。避免抽煙、劇烈運動及情緒劇烈波動等。采樣時受試者采取正位、端坐，采集時囑患者向4℃無菌Eppendorf 管內吐出，間歇性持續5 分鐘。將所得樣本立即于4℃，3000rpm，15min 離心取上層液體，將收集好的唾液上清凍存于-80℃冰箱，待檢測。

表1 兩組一般資料比較

3.常規牙周檢查：由兩名事先經過統一培訓的醫師使用Florida 探針對所有研究對象全口牙周檢查（第三磨牙除外）。主要內容包括6 個位點（近中頰側、正中頰側、遠中頰側、近中舌側、正中舌側、遠中舌側）的牙周探診深度（periodontal depth，PD）、附著喪失（attachment loss，AL）、菌斑指數（plaque index，PLI）、牙齦指數（gingival index，GI）。根據探診深度、牙齦指數、附著喪失、X 線片顯示牙槽骨吸收程度來衡量牙周炎的程度。

4.ELISA 檢測：從-80℃冰箱中取出待測標本，在室溫中放置10 分鐘，使其充分融化，取出ELISA試劑盒（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及 IL-10），使其平衡至室溫。按照試劑說明書設置標準品檢測孔：每塊ELISA 反應板設置8 孔標準孔，在第一孔中加入100μl 樣品稀釋液，然后加入100μl 標準品，充分混勻后，用移液器吸取1001μl 混合液，并加入第二孔中，然后加入100μl 樣品稀釋液混勻，依次倍比稀釋8 次，使之體積均為100μl。液器吸取100μl 待檢樣品加入ELISA 反應板，輕輕混勻，然后加蓋封板膜放入37℃恒溫箱中抗原抗體反應2小時。孵育結束后用洗板機洗板，洗5 次，每次45秒，然后在吸水紙上輕拍，去除ELISA 孔中水分。用移液器吸取100μl 第一抗體工作液加入ELISA 反應孔中，輕輕混勻，放于37℃恒溫箱中孵育1 小時。孵育結束后用洗板機洗板，洗5 次，每次45 秒，然后在吸水紙上輕拍，去除ELISA 孔中水分。板結束后在ELISA 反應孔加入100μl 辣根過氧化物酶標記的二抗，輕輕混勻，37℃溫育1 小時。孵育結束后用洗板機洗板，洗5 次，每次45 秒，然后在吸水紙上輕拍，去除ELISA 孔中水分。板結束后每孔加入底物A 液和 B 液各 50μl，輕輕混勻，37℃溫育 30 分鐘。取出ELISA 反應板，加入50μl 終止液，輕輕混勻。將ELISA 反應板放置酶標儀中，在450nm 波長處測定各孔的OD 值。將ELISA 反應板放置酶標儀中，在450nm 波長處測定各孔的OD 值。檢測樣本中相應細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及 IL-10）的含量。

5.Western Blot 檢測：首先從轉染48h 后的細胞中提取總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，然后在SDS-聚丙烯酰胺凝膠小孔內添加50μg 經過變性處理后的蛋白質，再進行濃縮膠層80V 恒壓一段時間，當樣品在分離膠層壓成一條線時電壓調至120V，繼續電泳，電泳后于冰上0.25mA 轉膜2h，麗春紅染色10min 觀察轉移效果，滿意后，洗膜緩沖液（tris buffered saline tween，TBST）緩沖液洗膜后在5%脫脂奶粉與搖床上孵育2h；加入一抗（1：500 兔抗人 p21 多抗，1∶5000 兔抗人GAPDH 單抗）置于4℃封閉過夜；洗膜后加入羊抗兔 IgG/HRP 二抗（1：2000），室溫孵育 1h，采用增強化學發光法（ECL）顯影得到蛋白印記條帶，用Tanon 軟件分析條帶灰度值，相對定量結果以實驗條帶灰度值/β-actin 條帶光密度值表示，內參照為β-actin。

6.qRT-PCR 檢測：應用 ABI StepOne Plus 實時定量PCR 儀，嚴格按照TaKaRa 公司SYBR Premix Ex TaqPCR 反應試劑盒的操作說明進行檢測。

7.統計學分析：實驗數據應用SPSS 22.0 軟件分析，計量資料用表示，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，多個樣本均數間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.在慢性牙周炎組與正常對照組唾液中miR-202 的表達水平：我們通過檢測miR-202 在慢性牙周炎組與對照組唾液上清中的表達水平，結果顯示，慢性牙周炎組唾液上清中miR-202 表達水平為2.46±0.62，正常對照組唾液上清中miR-202 表達水平為0.73±0.24，經獨立樣本t檢驗，慢性牙周炎組唾液上清中miR-202 表達顯著高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

2.miR-202 在慢性牙周炎各組唾液上清中表達水平：在1 實驗結果研究基礎上，我們繼續通過檢測miR-202 在正常對照組、輕度牙周炎組、中度牙周炎組、重度牙周炎組唾液上清中的表達情況。結果顯示，輕度牙周炎組唾液上清中miR-202 的表達水平為1.76±0.43；中度牙周炎組為2.69±0.61；重度牙周炎組為4.08±0.69，經單因素方差分析組間差異有統計學意義（F＝16.332，P＜0.01），見圖2。結果提示各組唾液上清中miR-202 表達存在差異，均顯著高于正常對照組，并呈現正相關性，且其差異有統計學意義（q＝6.321，8.447，9.368；P＝0.001，0.000，0.000）。

圖1 在慢性牙周炎組與正常對照組唾液中miR-202 的表達水平（±s）

圖2 miR-202 在慢性牙周炎各組唾液上清中表達水平（±s）

3.比較慢性牙周炎各組間唾液上清中miR-202表達相關分析：我們為更加確定miR-202 表達水平在各組間唾液上清的相關性，將各組間再經多重比較（表2）。miR-202 在輕度牙周炎、中度牙周炎、重度牙周炎唾液上清中之間表達水平顯著呈現上調趨勢（P＜0.01）。

表2 各組間唾液上清中miR-202 表達相關分析

4.miR-202 與慢性牙周炎臨床指標的相關性：我們通過觀察檢測慢性牙周炎患者的臨床指標：牙齦指數（GI）、牙周探診深度（PD）、菌斑指數（PLI）、附著喪失（AL）。結果顯示，miR-202 在唾液上清中的表達水平與各牙周臨床指標均呈顯著正相關（表3）。

5.慢性牙周炎患者唾液上清中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及 IL-10 水平變化：我們通過ELISA 方法檢測慢性牙周炎患者組和正常對照組人群唾液上清中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及 IL-10的表達水平，結果顯示，慢性牙周炎患者唾液上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 均顯著高于正常對照組，而IL-10 呈現低表達（表4），差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 miR-202 與慢性牙周炎臨床指標的相關性

表4 兩組唾液中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及 IL-10 水平比較（±s）

表4 兩組唾液中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及 IL-10 水平比較（±s）

標志物TNF-α IL-1β IL-6 IL-8 IL-10正常對照組（n＝51）4.57±2.68 10.03±4.83 3.22±0.98 32.51±13.48 14.97±9.04慢性牙周炎組（n＝85）9.87±6.58 47.94±14.79 6.37±3.64 148.63±39.67 5.76±3.46 t P 5.480 17.724 6.042 20.191 8.435 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

6.TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及 IL-10 在慢性牙周炎患者中蛋白水平變化：通過Western Blot 方法檢測慢性牙周炎患者組和正常對照組人群中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及 IL-10 的蛋白表達水平，同ELISA 檢測結果相同，慢性牙周炎患者中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 均顯著高于正常對照組，而IL-10 呈現低表達（圖3）。

7.miR-202 與 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及IL-10 表達水平的相關性：我們將慢性牙周炎患者治療前唾液上清中miR-202 的表達水平分別與唾液上清中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及 IL-10 的表達水平進行相關分析，結果顯示，TNF-α 的相關系數 r 值為 0.527，（P＜0.001），與 miR-202 呈正相關；IL-1β 的相關系數 r 值為 0.483，（P＜0.001），同樣和miR-202 呈正相關；IL-6 及IL-8 的相關系數r值分別為 0.424（P＜0.001）、0.391（P＜0.01） 也和miR-202 呈正相關，而IL-10 的相關系數r 值為-0.322（P＜0.01）則與 miR-202 呈負相關性，見表5。

圖3 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及 IL-10在慢性牙周炎患者中蛋白水平變化

表5 miR-202 與 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及IL-10 表達水平的相關性

討 論

慢性牙周炎是最常見的一類牙周炎，約占牙周炎患者的95%，由長期存在的慢性牙齦炎向深部牙周組織擴展而引起，主要臨床特征有牙齦炎癥、牙周袋形成、臨床附著喪失、牙槽骨吸收，嚴重者可出現牙齒松動、移位，最后導致牙齒缺失。由于附著于牙面的牙菌斑中的微生物所引起牙周支持組織破壞的慢性感染性疾病，細菌積聚于牙齒表面或直接侵入并同時產生大量毒性產物直接破壞牙周組織，或者引發了宿主免疫反應和炎癥反應，間接性地導致了牙周組織的損傷[9]。

miRNAs 是由21～24 核苷酸所組成并且存在于真核細胞當中的一個非編碼小分子RNA，通過抑制蛋白的轉錄和翻譯來調節細胞行為。miRNAs 不僅在細胞凋亡、遷移、增殖、分化等生理過程中發揮作用，也與炎癥疾病的發生發展有密切關系。研究表明，miRNAs 具有炎癥負反饋調節機制[10]。大量研究發現，miRNA 在調節和維持免疫功能方面發揮著極其重要的作用，miRNA 的異常表達緊密聯系慢性炎癥發病過程[11]。包括miR-202 在內的，與慢性炎癥相關的miRNA 分子中在慢性炎癥發生和發展過程中發揮著重要作用。miRNA-202 在免疫細胞的分化和功能調控、炎癥因子的信號轉導、自身免疫性疾病、病毒感染及腫瘤發生、發展過程中的作用。近年來，miRNA 在牙周炎的發生、發展及預后中的作用成為研究的熱點之一，已經得到證實的有miR-146、miR-155 等微小RAN 對慢性牙周炎發生發展機制的調節作用。本研究通過檢測miR-202 在慢性牙周炎組與對照組唾液上清中的表達水平，發現慢性牙周炎組唾液上清中miR-202 表達水平明顯高于正常人群，這提示miR-202 也可能參與慢性牙周炎的發生發展。

通過檢測正常人群及不同嚴重程度牙周炎患者唾液中miR-202 的表達情況，發現各組慢性牙周炎患者的唾液上清中miR-202 表達存在差異，均顯著高于正常對照組，并呈現正相關性，且其差異有統計學意義。為更加確定miR-202 表達水平在各組間唾液上清的相關性，將各組間再經多重比較，結果顯示，miR-202 在輕度牙周炎、中度牙周炎、重度牙周炎唾液上清中之間表達水平顯著呈現上調趨勢。我們通過觀察檢測慢性牙周炎患者的臨床指標：牙齦指數（GI）、牙周探診深度（PD）、菌斑指數（PLI）、附著喪失（AL）。結果顯示，miR-202 在唾液上清中的表達水平與各牙周臨床指標均呈顯著正相關。上述所有結果說明miR-202 與慢性牙周炎的嚴重程度密切相關，病情越嚴重，miR-202 表達水平越高。

TNF 是具有多種生物學活性的糖蛋白，也是唯一具有細胞毒作用的細胞因子，是炎癥反應的啟動物質，是最早發揮作用的前炎性因子。牙周炎過程中，TNF-α 的主要作用有刺激黏附分子、趨化因子的表達和炎性介質的產生，啟動炎癥反應，增加破骨細胞的形成和活性，增加基質金屬蛋白酶的產生，導致結締組織的破壞，刺激基質細胞凋亡從而限制了牙周組織的修復。有學者發現隨著牙周炎癥的發展，齦溝液中TNF-α 及其受體的總量均明顯升高[12]。

IL-1 是一種單核細胞因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，其分為IL-1α 和IL-1β 兩種。IL-1β 是多效性細胞因子，具有廣泛的細胞免疫調節作用，包括促進胸腺細胞、T 細胞活化、增殖和分化；促進破骨細胞形成和骨吸收；激活核轉錄因子NF-kappa B 的信號通路，進而NF-kappa B 上調IL-1β 基因的表達，加重牙周病變。這些炎癥介質能刺激破骨細胞和膠原酶，導致骨和牙周結締組織破壞，牙周組織修復能力喪失等。有研究表明，在炎癥部位的齦溝液中IL-1β 的水平與慢性牙周炎的臨床指標密切相關[13]。

IL-6 是一種多功能細胞因子，在機體的免疫應答及炎癥反應中均起著重要作用。可誘導成骨細胞產生破骨細胞分化因子及基質金屬蛋白酶，二者都促進牙槽骨的吸收，能輕度抑制成骨細胞堿性磷酸酶的活性和膠原的合成，從而抑制牙槽骨吸收后新骨的形成，可以抑制牙周膜的修復，抑制成纖維細胞等牙周膜細胞生長，并降低成纖維細胞附著，導致牙周膜修復能力減弱、牙周附著喪失，形成深牙周袋。IL-6 可參與牙周炎的炎癥反應，促進炎癥細胞的聚集、活化并促進炎癥介質的釋放。研究發現，在病變牙周組織及牙周炎患牙的齦溝液中IL-6 水平明顯高于正常，且與牙周組織破壞的嚴重程度有關[14]。

IL-8 炎癥因子則是由巨噬細胞和內皮細胞所分泌，作為一種白細胞多肽調節因子，IL-8 主要是通過金屬蛋白質水解及細胞外基質蛋白降低，從而破壞正常牙周組織加重炎癥感染。IL-8 可以趨化中性粒細胞，促進粒細胞吞噬效應，是機體重要的炎癥調節因子。近年來，有研究證實，IL-8 與牙周炎的發生發展密切相關。有人發現IL-8 在牙周炎的病變牙齦組織中其表達明顯升高，在經過牙周基礎治療后，多數患者的IL-8 水平有不同程度降低，這表明去除局部細菌、菌斑及其刺激因素后，齦溝液內IL-8 的水平趨于正常[15]。

IL-10 是機體內重要的免疫抑制因子，可抑制機體的免疫應答水平，降低炎癥反應，促進組織修復及愈合，其主要由Th2 細胞、單核巨噬細胞和活化的B 細胞產生。IL-10 可抑制單核細胞依賴性Th1細胞增殖，抑制 IL-2、TNF-α、IL-6、GM-CSF 等一系列細胞因子的合成及其活性。近年來研究發現，IL-10 可作為一種抗炎因子，抑制炎癥因子的合成和刺激保護性抗體的產生，參與牙周炎的產生和發展[16]。Goutoudi 等發現慢性牙周炎患者體內IL-10水平較健康人群表達降低，經過牙周基礎治療后，其局部炎癥反應減輕，IL-10 的表達水平增加，說明IL-10 可能通過對促炎因子的抑制作用，參與了牙周的修復過程。

miR-202 能通過依賴細胞核因子-KB（nuclear hcmr-KB，NF-KB）的方式表達上調，實現對TLR信號通路的負反饋調節，從而防止炎癥反應過激。為了探討miR-202 與炎性細胞因子之間的相關性。本研究通過ELISA 方法檢測慢性牙周炎患者組和正常對照組人群唾液上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及IL-10 的表達水平，結果顯示，慢性牙周炎患者唾液上清中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 均顯著高于正常對照組，而IL-10 呈現低表達。Western Blot 方法檢測結果同ELISA 一致。相關分析結果顯示，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 的表達與 miR-202呈正相關，IL-10 的表達水平與miR-202 呈負相關。分析可能是由于TLR4、TLR2、TLR5 通路的激活后，miR-202 高表達能夠通過NF-KB 信號通路誘導TNF-α、IL-1β、IL-6 及 IL-8 等細胞因子的表達水平增加。上述結果提示：慢性牙周炎患者唾液上清中 miR-202 表達升高與唾液上清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 及 IL-8 高表達有關。

綜上所述，慢性牙周炎患者唾液上清中miR-202 表達水平顯著升高，同時 miR-202 和TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性細胞因子呈正相關性，而miR-202 與IL-10 呈負相關性，提示我們miR-202 在慢性牙周炎發病過程中發揮著重要作用，有作為臨床上監測慢性牙周炎活動進展的生物標記的潛力。