m6A RNA甲基化在腫瘤發生發展中的作用

龍文林 郭輝 盛杰 宋如晦 徐瑤

（武漢科技大學生命科學與健康學院 生物醫學研究院，武漢 430081）

早在20世紀70年代，科學家們就發現了N6-甲基腺苷（m6A）修飾，m6A是能夠發生在mRNA、長鏈非編碼RNA（lncRNA）等RNA腺嘌呤（A）上的甲基化修飾［1]。在目前已知的171種RNA轉錄后修飾中［2]，m6A是大多數真核生物mRNA和lncRNA中最豐富的修飾之一，占哺乳動物RNA中腺苷酸的0.1%-0.4%和核糖核苷酸總甲基化的50%［3-4]。除了在植物和脊椎動物中存在著廣泛的m6A修飾外，在單細胞生物如細菌、酵母等RNA中也發現了這種修飾［3，5-8]。m6A修飾主要發生在RRACH（R = G或A，H = A，C或U）共有序列中［9-11]，通過高通量測序發現，m6A并不是隨意分布，而是在終止密碼子、3'非翻譯區（3'UTR）、和內部長外顯子聚集［12-14]，并且在前體mRNA中發現的更多［15-16]。類似于DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳修飾，m6A甲基化參與眾多細胞活動中重要功能基因復雜而精細的生物學調控，越來越多的研究表明，m6A修飾參與了人類復雜疾病的發生過程，尤其在癌癥的發生發展中扮演著重要的角色。本文綜述了m6A甲基化修飾的機制及其生理學意義，重點總結了其在不同腫瘤發生發展中的作用，旨在為癌癥的早期診斷、治療和預后提供新的研究策略。

1 m6AmRNA甲基化的調節機制及其生理學意義

通過對m6A相關蛋白的研究發現，m6A甲基化是一個動態可逆的過程［17]，它由甲基轉移酶復合體（Writers）、脫甲基酶（Erasers）和功能管理者（Readers）組成（圖1）。Writers是將甲基化修飾“寫入”RNA，即介導RNA的甲基化修飾過程。根據目前文獻報道，至少有以下7個成分組成了該復合體，METTL3/METTL14/WTAP/RBM15/KIAA1429/HAKAI/ ZC3H13。其中，最常見的分子是METTL3和METTL14，兩者可在體外和體內催化mRNA（和其他細胞核RNA）的m6A甲基化［18-19]。WTAP是這種甲基轉移酶復合體中的另一個關鍵組分［20]。METTL3充當催化核心，將甲基從S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉移至受體腺嘌呤部分。METTL14作為RNA結合平臺，促進RNA底物的結合并增強復合物的穩定性。METTL3-14復合二聚體誘導核RNA上的m6A沉積。METTL14的催化甲基化活性約為METTL3的10倍，WTAP不具有甲基轉移酶活性，然而，它與METTL3-14復合物相互作用以影響體內m6A甲基轉移酶活性和甲基化位點的準確定位［21]。RNA結合基序蛋白15（RBM15）有助于將復合物募集到其靶位點。KIAA1429（也稱為VIRMA）參與特定位點的METTL3-METTL14-WTAP募集，HAKAI也是甲基轉移酶的重要組成部分［22]。鋅指CCCH型13（ZC3H13）起著在細胞核中錨定WTAP、Virilizer和Hakai，以促進m6A甲基化的作用［23]。此外，有文獻報道，甲基轉移酶樣蛋白16（METTL16）被認為是用于修飾U6 snRNAs和各種非編碼RNA的甲基轉移［24-25]。Erasers能夠將RNA甲基化修飾信號“擦除”，即介導RNA的去甲基化修飾過程。脂肪量和肥胖相關蛋白（FTO）和AlkB同源物5（ALKBH5）是目前已知的兩種m6A去甲基化酶，FTO是Fe II /α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶AlkB亞家族的成員，它們是Fe（ii）和α-酮戊二酸依賴性的，使用亞鐵作為輔因子和α-酮戊二酸作為共同底物將m6A位點的N-甲基氧化成羥甲基，沉默或過表達FTO/ALKBH5都能改變細胞中m6A的水平［17，26-27]。Readers是負責“讀取”RNA 甲基化修飾的信息，并參與下游RNA的翻譯、降解等過程。其“讀取”方式有兩種模式，一種是直接閱讀，是指直接與RNA的m6A位點的選擇性結合。具有RNA結合結構域的YTH結構域家族是第一個被發現直接閱讀的“讀者”［28]，YTH（YT521-B同源性）家族蛋白YTHDF1-3和核成員YTHDC1和YTHDC2可直接結合含有m6A的RNA。YTHDF1促進m6A甲基化mRNA的翻譯，YTHDF2加速m6A甲基化mRNA的衰變，YTHDF3與YTHDF1和YTHDF2一起能顯著增強細胞質中m6A甲基化mRNA的代謝，YTHDC1通過促進SRSF3同時抑制SRSF10，從而影響mRNA剪接［21]。YTHDC2可提高翻譯效率并降低mRNA的豐度［29]。此外，不用于YTH結構域家族，RNA結合蛋白異質核蛋白A2B1（HNRNPA2B1）和真核轉錄起始因子3（EIF3）也能與RNA的m6A位點直接結合，HNRNPA2B1能結合到細胞核中的一部分miRNA轉錄本，并與DGCR8蛋白（pri-miRNA微處理器復合物的一個組成部分）相互作用，起到調節剪接和miRNA成熟的作用［30]。EIF3能與m6A位點直接結合，以促進不依賴帽的翻譯。另一種模式是間接閱讀，即m6A修飾改變RNA二級結構。這些結構改變促進幾種蛋白質的結合：異質核核糖核蛋白C（HNRNPC）和異質核核糖核蛋白G（HNRNPG）結合，負責pre-mRNA加工和mRNA成熟［31]。最近有研究發現了m6A的新的“讀者”——胰島素樣生長因子2mRNA結合蛋白（IGF2BPs，包括IGF2BP1/2/3），能夠識別共有序列GG（m6A）C從而靶向mRNA轉錄本，以促進mRNA的穩定性和翻譯［32]。隨著這些m6A重要的功能組成成分的不斷發現，對m6A甲基化修飾和調控功能的認識得到了極大的豐富，未來仍有廣闊的探索前景去更全面、更深入的了解m6A甲基化。

如上所述，m6A在“Writers”的作用下，在RNA上加入甲基，通過不同的“Readers”來識別那些m6A修飾的RNA產生不同的功能，包括RNA加工、核輸出、翻譯、衰變等。最后，依靠“Erasers”的作用讓m6A修飾這一過程變得動態、可逆，從而起到調節各種基因的表達的功能。也正是這種模式使得m6A甲基化修飾在生理過程中發揮了重要的作用。目前，越來越多的證據表明m6A甲基化修飾在生物鐘的控制［33]、精子的產生［34]、胚胎的發育［35]、維持胚胎干細胞多能性［36]、果蠅的性別決定［37]、T細胞的穩態［38]、熱休克反應［39]和調節心臟收縮功能［40]等過程中發揮了重要作用。同時，由于RNA調節與人類疾病息息相關，作為哺乳動物細胞中最豐富的內部修飾之一，m6A甲基化修飾被證實與多種疾病如肥胖癥［41]、Ⅱ型糖尿病［42]、不育［27]和神經元疾?。?3]等有關。其中，研究的熱點領域還是m6A甲基化修飾與腫瘤之間的關系，也是本文重點所在。

圖1 m6A甲基化修飾的分子機制

2 m6A mRNA甲基化修飾在腫瘤中發生發展中的作用

目前，m6A mRNA甲基化與腫瘤之間的研究受到廣泛關注，越來越多的證據表明，m6A mRNA甲基化與腫瘤的發生發展密切相關，m6A相關蛋白是腫瘤發生發展中的重要調節因子，其表達水平的高低往往直接決定了腫瘤的病理學進程。在不同類型的腫瘤中，m6A修飾既可以致癌，也可以抑癌（表1）。因此，研究m6A調控的基因在不同癌癥中的生物學功能，鑒定關鍵的m6A靶基因，對于了解癌癥發病機制具有重要意義。

2.1 m6A與膠質母細胞瘤（GBM）

膠質母細胞瘤是最具侵襲性的原發性惡性腦腫瘤，即使聯合采用手術切除、放射治療、化療等手段，患者診斷后存活率依然較低，且復發率高，平均生存期約為14.6個月，被世界衛生組織（WHO）評為IV級膠質瘤［44]。膠質母細胞瘤干細胞（GSCs）是一種具有促進腫瘤生長和侵襲能力的癌癥干細胞，并對化療和放療具有很強的抵抗能力，這些特性成為了膠質母細胞瘤治療差的主要原因。近幾年的研究發現，GBM與m6A修飾有著密切聯系。在初級GSCs中，mRNA上的m6A水平明顯降低，而當GSCs被誘導分化時，m6A水平增加。抑制METTL3或METTL14的表達能減少m6A水平，增強GSCs的體外生長和自我更新，并促進GSCs在體內形成腫瘤的能力。與此相反，METTL3的過表達或FTO抑制劑MA2能增加GSCs中m6A水平，抑制GSCs的增長和減緩腫瘤的發生發展。更重要的是，研究發現，在PBT003細胞系中，METTL3或METTL14的敲低導致了幾種癌基因（如ADAM19，EPHA3和KLF4）表達上調和腫瘤抑制因子（如CDKN2A，BRCA2和TP53I11）下調。相反，METTL3的過表達或用FTO抑制劑MA2處理導致上述癌基因的表達降低［45]。另一項研究表明，m6A去甲基化酶ALKBH5在GSCs中呈高表達，抑制ALHKBH5會減少GSCs的自我更新、增殖和腫瘤的發生。ALKBH5使FOXM1（FOXM1是細胞周期調控中的關鍵轉錄因子，并且在GSCs的自我更新和腫瘤發生中起關鍵作用）新生轉錄物去甲基化，通過結合3'UTR增強FOXM1表達，而FOXM1的核lncRNA FOXM1-AS（核lncRNA反義物）能進一步促進FOXM1新生轉錄物與ALKBH5的相互作用從而加強這一過程。敲除FOXM1-AS也會破壞GSC中的FOXM1表達和自我更新，并且在耗盡ALKBH5或FOXM1-AS后，通過過表達FOXM1能挽救GSC的腫瘤生長，進一步證明了FOXM1在GSC腫瘤發生中的關鍵作用［46]。因此，m6A甲基化和去甲基化能夠通過不同的調節機制影響膠質母細胞瘤中GSCs，從而對GBM的發生發展發揮了關鍵作用，為膠質母細胞瘤提供了新的治療靶標。

表1 m6A修飾相關蛋白表達水平與腫瘤發生發展

2.2 m6A與急性髓性白血病（AML）

急性髓系白血病（AML）是成人中最常見的急性白血病，占該組病例的約80%，具有較高的死亡率。AML是一種高度異質性的疾病，其生物學特征在于分化阻滯，增殖增加和細胞凋亡抑制。其發病機制在很大程度上取決于不同體細胞改變和染色體重排之間的相互作用，不同的細胞遺傳學異常t（8；21）（q22；q22），inv（16）（p13q22）/ t（16；16）（p13；q22），t（15 ；17）（q22 ；q11～21） 和 abn（11q23）和分子異常（FLT3-ITD，MLL PTD和NPM1突變）顯示出不同的發病機制［47]。AML是METTL3和METTL14表達水平最高的癌癥之一，與正常造血祖細胞相比，發現METTL3和METTL14在AML細胞中呈高表達，METTL3和METTL14在AML具有一致的致癌作用［48-49]。METTL3通過增加靶基因c-MYC（髓細胞瘤?。?，BCL-2（B細胞淋巴瘤2），PTEN（磷酸酶和張力蛋白同源物）的表達來抑制細胞分化和凋亡，并促進細胞增殖，并且PTEN轉錄物可編碼p-AKT的負調節物，通過激活PI3K/AKT途徑以促進分化并抑制自我更新［50]。METTL14在正常骨髓細胞生成中起抑制作用，而在AML中抑制細胞分化。在SPI1-METTL14-MYB / MYC軸中，METTL14被SPI1下調，通過m6A修飾調節MYB和MYC，在增強白血病造血干/祖細胞（HSPCs）自我更新和抑制骨髓分化中發揮致癌作用［49]。此外，WTAP作為m6A“Writers”的另一名成員，被證明與AML有關，WTAP也被描述為AML的新型致癌蛋白。與正常外周血單核細胞以及AML細胞系相比，AML中WTAP水平增加。升高的WTAP促進細胞增殖并抑制AML的細胞分化［51]。其中調節機制還有待進一步研究。脂肪量和肥胖相關蛋白（FTO）作為m6A修飾的重要一員，在造血細胞轉化中發揮著重要作用。已經報道了在AML某些亞型中，如t（11q23）/ MLL-重排，t（15；17）/ PML-RARA，FLT3 -ITD 和 /或 NPM1突變的亞型，FTO的表達升高，顯著促進AML細胞的存活和增殖，并抑制人AML細胞的分化和凋亡，并且高表達FTO顯著促進小鼠白血病的發生，當FTO的內源性表達耗盡時，情況正好相反。這是FTO通過靶向其UTR降低一組腫瘤抑制靶基因（如細胞因子信號傳導盒-2（ASB2）抑制因子和視黃酸受體α（RARA））的m6A水平，從而影響它們的穩定性［52]。此外，有研究發現，突變體異檸檬酸脫氫酶1/2（IDH1/2）產生大量的R-2-羥基戊二酸（R-2HG）作為代謝物，可通過抑制FTO活性增加m6A水平，導致MYC致癌基因和轉錄因子CEBPA mRNA穩定性降低，從而抑制白血病細胞增殖和降低其活力，并促進細胞周期停滯和細胞凋亡［53]。FTO作為脫甲基酶，目前在AML中的研究還處于起步階段，其具體的分子機制及下游調控基因還有待進一步闡明。與其他的表觀遺傳修飾相比，AML中的m6A修飾活性很容易被化學藥物所靶向，能夠為AML的新藥研發提供理論依據。

2.3 m6A與肝細胞癌（HCC）

HCC是一種主要的原發性肝癌，占全球惡性腫瘤發病率的第五位［54]，由于缺乏有效的干預措施，導致HCC的轉移和復發，使得HCC的發病率和死亡率逐年增加，因此我們需要深入研究癌癥進展的分子機制。越來越多的證據表明，肝癌的發生是一個涉及遺傳學、表觀遺傳學和轉錄變化之間復雜相互作用的多步驟過程［55]。轉錄組測序（RNA-Seq）結果顯示，METTL3在人肝癌細胞中被表達顯著上調，METTL3的過表達能夠促進HCC增殖和遷移，并顯著增強HCC的腫瘤形成。細胞因子信號傳導抑制因子2（SOCS2）作為METTL3的下游靶標，同時也是腫瘤抑制因子，METTL3通過m6A-YTHDF2依賴途徑降低SOCS2 mRNA穩定性從而促進HCC的發生與發展［56]。Zhao 等［57]發現 YTHDF1 的表達水平與HCC患者的病理進程有關，低表達YTHDF1的患者表現出更高的生存率。此外，YTHDF2與HCC的惡性程度密切相關，通過識別m6A位點來調節mRNA降解，導致HCC細胞增殖的增強，有研究發現，HCC患者中下調的miR-145可以通過直接靶向YTHDF2 mRNA的3'UTR來抑制YTHDF2的表達，可能成為肝癌治療的新的靶標［58]。而在另一篇報道中發現，相比于鄰近組織和正常肝組織，HCC中m6A水平是降低的。同時METTL14和FTO在HCC中均降低，而METTL3、WTAP、KIAA1429和ALKBH5沒有顯著變化。臨床數據顯示，METTL14減少的患者表現出更低的生存率。METTL14缺乏增強了HCC細胞的轉移能力，相反，METTL14的過表達抑制了細胞遷移和侵襲。進一步的實驗表明，METTL14可通過介導微處理蛋白（DGCR8）與pri-miRNA的識別和結合，促進pri-miR126加工成miR126，而miR126被鑒定為腫瘤轉移抑制因子［59]。這些研究都表明m6A修飾在HCC發生發展中具有重要作用。

2.4 m6A與乳腺癌

乳腺癌是所有女性惡性腫瘤中發病率最高的癌癥，盡管乳腺癌早期治療效果較好，但轉移后治療效果較差，具有高復發率和高死亡率。乳腺癌干細胞（BCSCs）是一組通過自我更新能夠無限增殖的亞群細胞。只有BCSCs可形成復發性或轉移性腫瘤［60-61]。乳腺癌細胞在缺氧環境中會增加乳腺癌干細胞（BCSCs）的比例，這是腫瘤起始和轉移所必需的條件，并且這種反應取決于缺氧誘導因子（HIF）的活性。HIF依賴性ALKBH5通過去甲基化增強多能性因子NANOG mRNA的穩定性，ALKBH5的過表達促進了BCSC中NANOG的表達和BCSC的富集，ALKBH5基因敲除可抑制腫瘤形成，減少體內BCSCs［62]。同時HIF還通過ZNF217（一種m6A甲基轉移酶抑制劑）和ALKBH5介導的乳腺癌細胞RNA甲基化來調控其他多能因子表達。ZNF217與ALKBH5相互作用并抑制多能性因子NANOG和KLF mRNA甲基化，最終導致KLF4和NANOG表達升高，從而促進腫瘤發生［63]。這些多能性因子的表達均依賴于HIF，有望成為乳腺癌治療的新的切入點。另一項研究顯示，在臨床乳腺癌樣品中METTL3的表達水平很高，乙肝病毒X蛋白結合蛋白（HBXIP）與METTL3之間相互作用，METTL3、HBXIP和miRNA let-7g之間形成一個正反饋環（HBXIP/let-7g/ METTL3/HBXIP），以促進乳腺癌細胞的增殖。 HBXIP通過抑制腫瘤抑制因子let-7g增強METTL3的表達。METTL3的增加反過來又通過促進mRNA中m6A的修飾來提高HBXIP的水平［64]。體內、體外實驗均證實，METTL3和ALKBH5能夠通過調節m6A的甲基化修飾水平，進而促進乳腺癌細胞的增殖和遷移，由此可見，調控m6A修飾可逆性的兩種蛋白（“Writers”和“Erasers”）在癌癥發生發展過程中具有相同的作用。目前，關于“Readers”在乳腺癌中的研究尚未見報道，存在很大的研究和探索空間。

2.5 m6A與肺癌

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，包括小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC約占85%，盡管目前肺癌的診斷和治療手段不斷提高，但5年生存率仍較低［65-66]。有研究發現，METTL3能促進EGFR、TAZ、MAPKAPK2（MK2）和DNMT3A等癌基因mRNAs的翻譯，且與甲基轉移酶活性無關。METTL3在肺腺癌中的表達較高，能促進人肺癌細胞的生長、存活和侵襲［67]。另一項研究發現，miR-33a通過靶向METTL 3 mRNA 3‘UTR結合而抑制NSCLC細胞的增殖，提示METTL3可能是非小細胞肺癌治療的新靶點［68]。最近，又有研究者發現，m6A脫甲基酶FTO通過調節髓樣鋅指1（MZF1）的表達，促進肺鱗狀細胞癌的進展，MZF1是SCAN-Zinc Finger（SCAN-ZF）轉錄因子家族的成員之一，通過調節其在不同類型癌癥中的多種靶基因，促進細胞的增殖、遷移和轉移。FTO通過降低MZF1mRNA轉錄本中m6A水平和mRNA穩定性而增強MZF1的表達，從而產生致癌作用［69]。m6A修飾關鍵酶調控的靶基因在不同癌癥類型中有所不同，因此，篩選m6A修飾的下游關鍵基因對于闡明腫瘤發生發展的分子機制及未來的臨床治療都至關重要。盡管在肺癌中已有部分靶基因被揭示，但是其功能還需通過體內實驗進一步證實。

3 結語

在過去幾年中，由于高特異性抗體的可用性和高通量測序技術的可及性，鑒定m6A RNA甲基化的化學基礎和多種功能已經成為可能。尤其是m6A IP（交聯和免疫沉淀）和RNA-seq技術的快速發展，m6A已被證實參與了多種惡性腫瘤的發生發展。這將使得m6A相關酶或m6A依賴途徑的靶向成為可能，從而為m6A靶向治療人類癌癥提供了重要的科學依據。然而，盡管m6A在癌癥中的作用已經逐漸被揭示，但仍然存在著許多挑戰。首先，某些腫瘤中m6A調節因子的機制在很大程度上是未知的，比如m6A甲基化修飾中“Readers”在癌癥中的作用和機制仍然是個很大的空白；其次，雖然很多研究顯示，m6A相關調節因子和作用途徑可作為癌癥治療中的新的靶點，但缺乏一定的臨床實踐，而m6A在許多方面都能影響基因的表達，其副作用也不可忽視。未來的工作，旨在深入研究m6A修飾中的“Writers”、“Erasers”和“Readers”參與疾病進程調節的分子機制，結合臨床數據評估m6A與疾病的相關性，進一步增強我們對腫瘤惡性轉化的理解，并有助于設計新的癌癥治療藥物。