無巖藻糖修飾曲妥珠單抗的研究進展

雷莎莎 朱紅雨 張國華 徐明波 楊仲璠 姚文兵

（1. 中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 210009；2. 北京雙鷺藥業股份有限公司北京市重組蛋白及其長效制劑工程技術研究中心，北京 100143）

據2018年最新國家癌癥中心發布的數據，乳腺癌位居女性惡性腫瘤發病率首位。根據基因表達模式不同可將乳腺癌分為四個亞型：基底細胞 樣（Basal-like type）、HER2過 表 達 型（HER2-overexpressing type）、管腔 A 型（Luminal subtype A）、管腔B型（Luminal subtype B）。不同亞型的乳腺癌常伴有不同的臨床特征差異，在復發率和總生存期方面也存在差異［1]。其中，約有15%-30%乳腺癌患者表現為HER2陽性［2-3]，而HER2陽性也意味著腫瘤細胞惡性程度更高、疾病進展速度更快、更易發生轉移和復發、預后不佳等臨床表現。因此，HER2陽性乳腺癌也被稱為“最兇險的乳腺癌”［4]。

1 曲妥珠單抗簡介

曲妥珠單抗為抗乳腺癌藥物赫賽?。℉eceptin）的活性成分，是首個以人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2，C-ErbB-2）為靶點的人源化單克隆抗體藥物。該單抗分子量為148 kD，可選擇性地作用于HER2的胞外結構域。赫賽汀最早由羅氏研發，1998年獲得美國食品及藥物管理局批準上市，用于HER-2陽性乳腺癌的治療。目前曲妥珠單抗產品已被應用于乳腺癌從晚期到輔佐治療以及新輔助治療的各個階段，能減緩腫瘤發展速度，明顯延長患者生存期［5]。

目前中國市場上的曲妥珠單抗產品，只有羅氏生產的赫賽汀，其原零售價格平均為24 500元/支（含量440 mg），而患者一個治療周期至少需要注射14支，意味著一個治療周期需要30多萬，這一費用對于國內多數患者來說是無法承擔的，因此這種治療方案的經濟可持續性引起密切關注［6]。2017年赫賽汀納入國家醫保目錄，下調為7 600元/支，這代表著未來對該產品的需求將進一步擴大。2018年3月開始，多地市場出現“藥荒”，很多患者由于無法購買到藥物而被迫停止治療。為了打破羅氏赫賽汀對市場的壟斷、降低治療成本、滿足市場需求，國內藥企紛紛投入到赫賽汀生物類似藥的研發中。國家藥監局藥品審評中心公布的數據顯示，目前赫賽汀生物類似藥國內臨床申報情況如表1所示。除生物類似藥，國內藥企也加緊自我新藥研發，一些靶向HER2的創新抗體藥物已申報臨床。其中主要是ADC藥物（如：齊魯制藥的注射用重組抗HER2人源化單克隆抗體-DM1），也有雙特異性抗體（如友芝友的注射用重組抗HER2和CD3人源化雙特異性抗體）以及單抗（如：麗珠的重組抗HER2結構域Ⅱ人源化單克隆抗體注射液）等。與生物類似藥相比，創新藥具有研發和市場雙重高風險，只有兼顧臨床療效和價格，才能有望取得市場優勢。

作為乳腺癌治療領域內第一個分子靶向性藥物，曲妥珠單抗單藥有效率為12%-34%，在和多種化療藥物聯合治療過程中也體現出有協同或相加作用［7]。曲妥珠單抗與鉑類、長春瑞濱、多西他賽、環磷酰胺有協同作用，與多柔比星、紫杉醇有相加作用。盡管如此，仍約有40% 的轉移性乳腺癌患者表現出對曲妥珠單抗治療的新生（原發）耐藥性，并且大部分HER2陽性患者在經過1年的曲妥珠單抗治療后，也會產生繼發性耐藥。此外，HER2低表達、異質表達或可疑表達的患者也均不適合使用曲妥珠單抗進行治療。

表1 赫賽汀生物類似藥國內臨床申報情況

曲妥珠單抗與HER2的結合對以HER2上調作為擴增基礎的腫瘤細胞具有直接抑制作用。曲妥珠單抗破壞配體非依賴性HER2-HER3二聚體相互作用，導致HER3/PI3K/AKT信號傳導的快速抑制，最終引起CDK2抑制劑p27的增加，導致癌細胞的細胞周期停滯［8-10]。此外，曲妥珠單抗還能抑制HER2胞外域脫落［11]。除了直接抑制腫瘤細胞信號傳導外，曲妥珠單抗還可以通過抗體的Fc片段介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用（Antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。ADCC效應依賴于抗體的Fc部分與先天免疫的免疫效應細胞上的Fcγ受體（FcγR）之間的相互結合來實現，特別是表達FcγRIIIa的自然殺傷細胞，且這種結合受到FcγRIIIa158纈氨酸（V）/苯丙氨酸（F）基因組多態性的影響［12]。Clynes等［13]發現當對曲妥珠單抗的Fc端進行一定修飾后ADCC效應消失，而對小鼠的FcγR進行敲除后，曲妥珠單抗的療效也顯著降低。最近的一項臨床研究顯示自然殺傷細胞的功能與轉移性乳腺癌患者對曲妥珠單抗治療的效應之間存在相關性［14]。這些報道支持了曲妥珠單抗通過ADCC效應實現治療效果的事實，并且證實增強ADCC效應可以成為一種潛在的提高曲妥珠單抗治療效果的方法［15]。

抗體介導的ADCC強弱和許多因素有關，如抗體與抗原的親和力、抗體與Fc段受體的親和力、免疫效應細胞的特性等。一般情況下，抗體與抗原或Fc受體的親和力越高，其介導的ADCC作用越強。因此，對抗體的Fc段進行改造，提高其對Fc受體的親和力也是提高ADCC效應的一個有效途徑。研究發現當完全敲除曲妥珠單抗Fc端N連接寡糖的核心巖藻糖時，低劑量使用即可引起強的ADCC效應［16]。通過敲除曲妥珠單抗的核心巖藻糖來改善其臨床療效也成為一個重要的研究方向。

2 曲妥珠單抗核心巖藻糖的敲除

敲除巖藻糖可明顯增強抗體的ADCC效應，其內在分子機制是由于巖藻糖的敲除引起抗體Fc端恒定區構象發生改變［17-19]，導致Fc與NK細胞上的FcγRIIIa結合作用增強，避免血清IgG蛋白與抗體競爭結合NK細胞上的活化Fc受體，從而抑制抗體的 ADCC作用［20-21]。研究表明，α-1，6巖藻糖基轉移酶（α-1，6 fucosyltransferase，FUT8）可催化GDP-巖藻糖上的巖藻糖轉運到GlcNAc內部，通過α-1，6糖苷鍵連接，形成Fc段寡糖的核心巖藻糖［22]。FUT8可能是催化巖藻糖 α-1，6連接的唯一關鍵酶［23]。因此，生產完全無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗可通過構建內源性FUT8基因完全敲除、穩定生產出無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗的特異性細胞株來實現?？赏ㄟ^以下多種方式敲除FUT8基因。

2.1 敲除FUT8基因

Yamane等［24]通過序列同源重組技術成功靶向破壞CHO/DG44細胞系中的FUT8等位基因，產生的FUT8-/-CHO/DG44細胞株可表達完全無巖藻糖修飾的抗體。研究表明，FUT8-/-細胞系產生的抗CD20 IgG1與人類FcγIIIa受體具有很強的結合能力，并顯著增強ADCC效應，使ADCC增加到正常CHO/DG44細胞株產生抗體的大約100倍。然而，在實現基因敲除時，發生非同源重組的頻率遠高于同源重組，這導致同源重組策略耗時且費力［25]。此外，產生完全無巖藻糖修飾的抗體或FUT8基因的完全敲除是可逆的，而重新敲除FUT8基因也成為利用同源重組技術產生FUT8-/-CHO細胞系作為生產抗體的宿主細胞的一大挑戰［24，26]。

Mori等［27]使用小干擾 RNA（siRNA）在產生抗體的CHO/DG44細胞系中靶向敲除FUT8，選擇凝集素（LCA）進行篩選后，分離得到的細胞系中有60%可穩定表達無巖藻糖修飾的抗體。與正常CHO/DG44細胞株相比，ADCC效應提高100倍以上。此外，該細胞系非常穩定，即使在無血清分批補料培養中也可產生去糖基化抗體。

鋅指核酸酶（ZFN）和轉錄激活物樣效應核酸酶（TALEN）技術也可用于破壞 FUT8基因［26，28]。Malphette等［26]在3周內利用ZFN技術破壞FUT8基因，得到了FUT8-/-CHO細胞，并以此細胞生產出完全巖藻糖修飾的抗體，該抗體具有正常的糖基化模式，且沒有其他的不利表型。Cristea等［28]通過同時采取ZFN技術和TALEN核酸酶技術實現了FUT8基因的敲除。該技術主要通過序列特異性DNA結合結構域組成的ZFN和TALEN與非特異性DNA核酸酶連接，引起DNA雙鏈斷裂，從而進行基因層次的遺傳調節。然而，DNA雙鏈斷裂易引起非同源末端連接或同源性定向修復出現錯誤，可能導致基因突變和蛋白質功能喪失［29]。

CRISPR/Cas9基因修飾系統可特異性地進行基因編輯［30]。Rond等［31]通過破壞編碼寡糖中FUT8的特殊位點基因，首次證實了CRISPR/Cas9技術可有效用于CHO細胞的基因編輯。此外，以LCA進行篩選測試的結果表明靶向FUT8基因的sgRNAs引起的缺失頻率高達99.7%。Sun等［29]使用CRISPR/Cas9技術對CHO細胞進行基因改造，3周內FUT8-/-CHO細胞株的成功率為9%至25%，當使用LCA進行篩選后，成功率可增強至52%。通過基因編輯產生的FUT8-/-CHO細胞系可產生無巖藻糖修飾的治療性單克隆抗體，而此基因敲除對細胞生長、存活力以及產品質量均未產生不利影響。此外，Grav等［32]使用CRISPR/Cas9技術對FUT8、BAK和BAX進行三重靶向敲除后，得到一個可穩定表達無巖藻糖修飾抗體且表達量明顯提高的細胞系。

2.2 其他去除巖藻糖的方法

GDP-巖藻糖作為巖藻糖的轉運媒介，為FUT8催化核心巖藻糖基化形成的過程中提供核心巖藻糖底物。GDP-巖藻糖通過兩條不同途徑合成：從頭路徑和補救途徑。從頭路徑通過鳥苷二磷酸-甘露糖脫水酶（GDP-mannose-4，6-dehydratase，GMD）將GDP-甘露糖轉化成GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖；然后通過鳥苷二磷酸-4-酮-6-脫氧甘露糖異構還原酶（GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose epimerase/reductase，GMER或FX蛋白）將該酮中間體轉化為GDP-巖藻糖。補救途徑直接將從細胞外來源或從溶酶體分解代謝釋放的巖藻糖轉運到細胞質基質中合成GDP-巖藻糖，這一轉運過程是通過巖藻糖激酶和GDP-巖藻糖焦磷酸化酶（GFPP）實現［33]。隨后，由這兩條途徑合成的GDP-巖藻糖通過GDP-巖藻糖轉運蛋白（GFT）被運輸到高爾基體的內腔［34]。

CHO-Lec13細胞由于內源性GMD的缺乏，在GDP-巖藻糖形成中天然缺陷，可應用Lec13細胞作為表達無巖藻糖修飾抗體的宿主細胞系。但從Lec13細胞中分離的單抗顯示出多種巖藻糖基化模式，大多數單抗產生50%-70%巖藻糖基化［35]。siRNA技術可成功介導巖藻糖基化途徑相關酶FUT8、GMD和GFT的沉默并降低抗體巖藻糖基化的含量［36]。但實驗結果表明該敲除過程可能會產生不可預測的脫靶效應，暫時無法順利產業化［37]。Louie等［38]利用CRISPR/Cas9技術得到FX基因敲除的CHO-K1細胞系，并證實該細胞系能表達完全無巖藻糖修飾的抗體。此外，也可通過GFT基因（Slc35c1）失活或突變阻止抗體在高爾基體中發生巖藻糖基化修飾［39]。通過該方法產生的Slc35c1基因失活的CHO細胞系在無血清懸浮培養條件下的細胞生長速率、活細胞密度和抗體生產力均無改變，且已應用于產生無巖藻糖修飾抗體研究［40-41]。

通過細胞工程和培養基修飾等策略也可以改變抗體巖藻糖基化狀態，進而提高ADCC效應。抗體表達的糖基化與其培養條件之間存在復雜的關系，宿主細胞類型、培養基和培養過程等參數會對抗體糖基化產生顯著影響。圖1總結了不同培養操作條件的影響［42]，具體使用哪一種還需要考慮技術的有效性和實際實施，以及生物制造兼容性和可用性等其他因素［43]。

此外，巖藻糖基化的生化抑制劑［44]、植物細胞作為表達平臺［45]、化學酶重塑［46]等方法也被開發用來產生無巖藻糖修飾的抗體。

3 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗的臨床優勢

曲妥珠單抗在乳腺癌治療中的具有明顯的臨床療效。然而，藥物的有效性存在局限性［47]。巖藻糖敲除的曲妥珠單抗在體外活性和體內藥效學評價上都具有明顯的優勢，有望在不久的將來取代曲妥珠單抗。

圖1 各種培養參數對哺乳動物細胞的糖基化途徑中的各種酶和糖核苷酸前體的影響［42]

圖2 治療性抗體誘導的ADCC［48]

3.1 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗保留FcγR非依賴性功能

曲妥珠單抗可直接抑制腫瘤細胞的信號傳導，并導致細胞周期停滯和增殖抑制。研究表明巖藻糖的敲除不會影響曲妥珠單抗的FcγR依賴性功能。這些功能包括HER2結合，對PI3K途徑的瞬時抑制和對腫瘤細胞增殖的持續抑制［49]。

3.2 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗避免血漿IgG蛋白的抑制作用

血漿IgG蛋白與抗體競爭結合NK細胞上的活化Fc受體，從而抑制抗體的ADCC作用［50]。無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗對NK細胞上的FcγRIIIa具有更大的親和力，可避免血漿IgG蛋白的抑制作用。無巖藻糖的曲妥珠單抗的這種對天然IgG干擾的逃避機制，可利于其在臨床使用中實現更高的細胞毒性效力，因此低劑量的抗體即有可能產生療效。

3.3 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗體外ADCC效應增加

Suzuki等［51]分別使用健康志愿者和乳腺癌患者的外周血單核細胞作為受體細胞，MCF-7或SKBR-3（2個具有不同HER2表達水平的乳腺癌患者的細胞系）作為靶細胞，以比較曲妥珠單抗和無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗各自的ADCC效應。無論使用健康志愿者組還是乳腺癌患者組的外周血單核細胞作為受體，無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗的ADCC效應明顯強于曲妥珠單抗。無論患者的身體情況如何，都可以觀察到ADCC效應的增強，即使是自然殺傷細胞數量下降、ADCC效應減弱的化療組。初步體外實驗顯示無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗可以提高抗HER2治療療效，而且不依賴于患者的疾病治療情況。

3.4 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗的體內療效增加

為了評估無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗在體內的功效，Junttila等［49]以每周3次10 mg/kg的方案注射曲妥珠單抗或無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗，以評價巖藻糖敲除是否對曲妥珠單抗在抑制SCID-beige小鼠乳腺脂肪墊中KPL-4異種移植物生長的作用。與敲除前相比，無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗更有效地抑制KPL-4腫瘤的生長。此外，接受無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗治療的小鼠的中位無進展生存期增加一倍以上。其中，曲妥珠單抗的中位無進展生存期為23.4 d，而巖藻糖敲除后的中位無進展生存期為48 d。這些結果表明無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗的體內療效優于曲妥珠單抗。

3.5 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗的臨床適應癥增加

TrasGEX是針對糖基化部位進行改造所得的第二代曲妥珠單抗產品，與傳統曲妥珠單抗相比，TrasGEX的N-聚糖只含有少量巖藻糖。TrasGEX與NK細胞上FcγRIIIa受體的結合親和力更高，且在充分保持其結合力的同時可增強ADCC效應。TrasGEX可引起所有高HER2和低HER2表達乳腺癌FcγRIIIa供體細胞的ADCC效應，因此具有更廣譜的殺傷作用。目前正在進行I期劑量遞增研究以確定可用于II期研究的最佳劑量和方案，并評價TrasGEX的安全性，藥代動力學和初步抗腫瘤活性［52]。體外和體內研究表明，對傳統曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌細胞仍保留了對ADCC殺傷效應的敏感性［53]。提高無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗用藥劑量可以改善HER2陽性患者治療過程中出現的耐藥性（原發性或繼發性）。此外，無巖藻糖修飾曲妥珠單抗未來也可能用于有可疑、異質或低HER2表達的乳腺癌患者，這可能是由于其具有顯著的ADCC效應。這表明無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗有著更廣泛的患者群體和更大的市場。

4 單抗Fc段其他改造方法的探索

除了目前研究比較成熟的Fc段N連接寡糖的核心巖藻糖敲除外，研究者也探索出了其他針對曲妥珠單抗Fc段進行改造的方法，期望能夠改善其ADCC效應。

Nordstrom 等［54]設 計 出 了 MGAH22， 一 種與曲妥珠單抗具有類似特異性和親和力的嵌合抗HER2單克隆抗體，其Fc結構域被改造以增加與人FcγRIIIa-158V/V基因型的外周血單核細胞的結合，而該基因型相比其他不同基因型的外周血單核細胞可引起更強的ADCC效應。Fc結構域改造后得到的抗體可更強地引起所有進行考察的HER2陽性腫瘤細胞的ADCC效應和抗腫瘤細胞增殖活性，且這種效應的提升對于那些低HER2表達水平的細胞也同樣適用。此外，MGAH22在轉入人FcγRIIIa-158F（F/F or V/F）基因的小鼠中表現出更好的靶向HER2表達性腫瘤的活性。而在一項使用食蟹猴的單一和重復劑量毒理學研究中，MGAH22在所有考察劑量下都具有良好的耐受性（15-150 mg/kg），且藥代動力學參數與其他抗HER2抗體相似。體內與體外實驗均表明，MGAH22在誘導細胞因子釋放方面與大多數的野生型mAb或曲妥珠單抗能力相似。這些數據為MGAH22進入后續臨床開發提供了有利證據，且其可用于具有低HER2表達腫瘤或攜帶FcγRIIIa低結合等位基因的患者。

Jo等［55]利用大腸桿菌內膜表達系統，通過定向改造結合隨機突變策略改造IgG的非糖基化Fc區，得到保留了與FcγRIIIa的結合能力并且可以有效發揮ADCC效應的非糖基化Fc突變體。改造之后，利用流式細胞術進行多輪高通量篩選分離出與曲妥珠單抗相比具有更高FcγRIIIa親和力的非糖基化抗體 Fc突變體AglycoT-MG48和AglycoT-MG59。盡管AlycoT-MG48和 AglycoT-MG59的 FcγRIIIa親 和 力高于曲妥珠單抗，但ADCC活性低于糖基化IgG抗體。與曲妥珠單抗相比，非糖基化改造Fc突變體的ADCC活性較低，可能是由于對FcγRIIb的結合親和力增加。FcγRIIb是一種通過抑制免疫細胞活化以抑制抗腫瘤活性的抑制性受體。盡管已有的實驗結果不是非常理想，然而通過進一步改造以降低與抑制性FcγRIIb受體結合能力的操作，有可能產生表現出更好的ADCC效應和腫瘤細胞殺傷活性的非糖基化Fc突變體曲妥珠單抗［55-56]。

Chen等［57]通過對Fc結構域進行改造得到可與FcγR接觸的額外環結構，通過構建編碼這些環中片段內所有可能的氨基酸多樣性的文庫，從而篩選富集得到具有改善低親和力FcγRIIIa結合活性的突變體。其中非糖基化IgG1突變體DTT-IYG在各個評價模型中均可有效地替代野生型Fc。且理論上由于DTT-IYG不需要糖基化就可有效地與FcγR結合，因此此類抗體的表達系統得以擴展。

在改善抗體Fc突變體與FcγRIIIa親和力時，其相應的表達量以及生物物理特性，如穩定性、血清半衰期、免疫原性等也需要納入考慮。此外，Fc突變體能否介導ADCC活性的增強才是決定該變體是否進行下一步研究的關鍵。從其成藥性來看，需要從非臨床和臨床研究等多方面進行評估。

5 結語

曲妥珠單抗用于HER2陽性乳腺癌的治療的安全性和有效性已毋庸置疑。然而，藥物的有效性存在局限性。抗體翻譯后糖基化的研究為抗體細胞毒性作用提供了新的研究思路，通過對抗體Fc段改造，特別是核心巖藻糖的敲除可以顯著增強曲妥珠單抗ADCC效應。

無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗不僅可以改善HER2陽性患者治療過程中出現的耐藥性，也可能用于有可疑、異質或低HER2表達的乳腺癌患者，從而擴大適應癥范圍，這對于改善乳腺癌患者群體的治療效果具有非常重要的意義。因此，完全無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗，未來值得作為新一代降低劑量、提高療效的抗體治療應用于患者，這將對基于ADCC機制的人類腫瘤治療產生巨大的影響。盡管關于曲妥珠單抗核心巖藻糖的敲除已經具有很多相關報道，但都存在一定的局限性，如巖藻糖敲除不徹底或完全敲除后可逆、容易引起基因突變或蛋白功能喪失、細胞株表達不穩定、耗時耗力、成本高等。如何經濟有效地產生完全無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗是目前急需解決的一大問題。