三種重要水果褐腐病菌快速檢測試紙的研制

林惠嬌 楊華衛 古恒森 蔣湘 張海磊 劉昱辰 周而勛

（1. 黃埔海關，廣州 510730；2. 江蘇獵陣生物科技有限公司，南通 226400；3. 華南農業大學農學院，廣州 510642）

褐腐病（Brown rot）是核果及仁果類水果生產及貯藏期重要的病害，在世界分布較為廣泛，為害果樹引起枝梢潰瘍、花葉枯萎、果實腐爛，導致嚴重損失［1-4]。褐腐病主要由子囊菌鏈核盤菌屬（Monilinia）中的3個種，即美澳型核果褐腐菌（M.fructicola）、核果褐腐菌（M. laxa）和仁果褐腐菌（M.fructigena）所引起。M. fructicola被認為是其中最具有毀滅性的植物病原菌［5]，被歐盟、非盟、智利、約旦、以色列和巴林定為檢疫性有害生物（EPPO global data base：https：//gd.eppo.int/）。該菌也是我國禁止入境的植物檢疫性有害生物［6]，具有重要的檢疫意義。另外兩種褐腐病菌，M. fructigena被美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭和智利列為檢疫對象，而M. laxa則是約旦關注的檢疫對象。

褐腐病菌既能在果樹生長期和果實儲藏期造成為害，也可在果實中潛伏侵染隨病果遠距離傳播，加之其環境適應性很強，對我國水果產業造成嚴重威脅。由于3種褐腐病菌關系相近，傳統依靠菌落特征、分生孢子大小、分生孢子萌發產生的芽管、產孢量等形態和生理特征進行區分非常困難［7-9]，要求鑒定者必須具備豐富的真菌分類學基礎與經驗。此外，傳統檢驗方法周期長，難以滿足口岸水果快速通關的要求，因此建立快速準確的檢測方法以防止該類病原真菌的傳播尤為必要。

鑒于褐腐病菌的重大經濟意義，許多研究者從多方面尋求更可靠的檢測方法，包括普通PCR檢測［10-18]、巢式 PCR 檢測［19]、多重 PCR 檢測［20-21]、SYBR green實時熒光PCR 檢測［22]、TaqMan實時熒光PCR檢測［23-26]，以及近年發展起來的PCR高分辨率熔解分析技術（High-resolution melting，HRM）［27]和疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA）結合qPCR檢測技術［28]。試紙檢測技術是一種基于目視判別顏色變化的可視化快速檢測技術，具有直觀、快速、簡便的特點，目前已在食品檢測和醫學等領域得到廣泛應用。迄今為止，國內外尚未見該技術應用于水果褐腐病菌檢測的報道。本實驗旨在根據水果上3種重要的褐腐病菌的EF-1α基因特異序列，進行引物及探針的篩選，開發出可應用于口岸檢疫的水果褐腐病菌快速檢測試紙。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 真菌DNA提取試劑盒、檢測試紙試劑盒（含前處理液、探針稀釋液、后處理液、不對稱擴增預混液、反應液A、反應液B、洗液、顯色液及試紙雜交盒）購自江蘇獵陣生物科技有限公司；硝酸纖維素膜為德國賽多利斯產品；普通PCR擴增試劑（Ex Taq DNA Polymerase、Ex Taq Buffer、dNTP等）、克隆試劑盒（pMD 19-T Vector Cloning Kit）均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 供試菌株及DNA 供試菌株包括了近年來黃埔口岸和珠海口岸植物檢疫實驗室截獲的來源于國外的7個美澳型核果褐腐病菌菌株，其他褐腐病菌購自中國農業微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China，ACCC）、中國林業微生物菌種保藏管理中心（China Forestry Culture Collection Center，CFCC）和北納創聯生物技術有限公司（BeNa Culture Collection，BNCC）等國內菌種保存機構，陰性對照菌株Botrytis cinerea、Botryotinia fuckeliana、Botryosphaeria dothidea和Pestalotiopsis neglecta為本實驗室從進境水果上分離的菌株。供試菌株來源、寄主等相關信息見表1。將供試菌株在PDA平板上于22℃、黑暗培養7-10 d，收集菌絲，用真菌DNA提取試劑盒按操作說明提取基因組DNA，-20℃保存。

表1 供試菌株信息

1.1.3 供試質粒及檢測標準品 陽性供試質粒共3種，為本課題組前期構建。從菌株M. fructicola（1-42093）、M. laxa（CFCC 80293）和M. fructigena（BNCC 116805）基因組DNA擴增EF-1α基因部分片段，分別將擴增到的目標片段插入pMD19-T載體中，構建pMD19-Mfcl、pMD19-Mlx和pMD19-Mfgn 3種重組陽性克隆。以帶有M. fructicola、M. laxa和M.fructigena目標基因EF-1α片段的重組陽性質粒DNA為檢測標準品。用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀（Thermo Fisher Scientific，USA）測定標準品DNA濃度后稀釋至10 ng/μL，-20℃保存。

1.1.4 供試引物和探針 根據3種褐腐病菌M.fructicola、M. laxa和M. fructigena的EF-1α序 列，設計了一對通用引物Mon F/Mon R、3條種特異性探針Mfcl-P、Mlx-P和Mfgn-P（圖1）。引物和探針具體序列見表2，由上海生物工程股份有限公司合成，下游引物Mon R的5'端連接生物素標記。

圖1 本文設計的引物和探針在Monilinia spp.的EF-1α序列中的位置

表2 試驗用引物和探針序列

1.2 方法

1.2.1 水果褐腐病菌檢測試紙的制備 將硝酸纖維素膜用前處理液處理后，在干燥箱中80℃烘烤10 min。將各探針干粉用純水溶解稀釋到40 μmol/L，然后用探針稀釋液稀釋到4 μmol/L，用移液器將稀釋后的探針點在硝酸纖維素膜上，在干燥箱中60℃烘烤15 min。然后放入后處理液中浸泡10 min，取出用純水簡單沖洗晾干，即為水果褐腐病菌檢測試紙（Moniliniadipstick，MON試紙）。

1.2.2 單鏈檢測靶標的擴增 以表1中供試菌株的基因組DNA或標準品質粒DNA為模板，采用引物Mon F/ Mon R進行不對稱PCR擴增。反應體系為20 μL：包括13 μL不對稱擴增預混液、1.2 μL正向引物Mon F和2 μL反向引物Mon R、2 μL模板DNA，加雙蒸水補至20 μL。反應程序為：94℃預變性4 min；然后以 94℃ 5 s，43℃ 1 s，68℃ 7 s進行 40 個循環；最后94℃ 5 s，63℃ 1 s，68℃ 7 s結束反應。擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 試紙檢測 將擴增產物、600 μL的反應液A、1 μL的反應液B混合后，與MON檢測試紙一起加入到雜交盒中，45℃振蕩雜交5 min，去雜交液后用2 mL洗液搖洗1 min（重復一次），倒去洗液后加入500 μL顯色液，避光顯色3 min，肉眼判讀結果。MON試紙檢測原理如圖2所示。

1.2.4 結果判讀 如圖3所示（示意圖中顯色點為軟件繪制），若顯色結果為A，則表示試驗失敗；若顯色結果為B，則表示檢測結果為陰性，即樣品中未含有M. fructicola、M. laxa和M. fructigena中的任一菌株；若顯色結果為C，則表示樣品中含有M.laxa菌株；若顯色結果為D，則表示樣品中含有M.fructigena菌株；若顯色結果為E，則表示樣品中含有M. fructicola菌株。當樣品中含有M. fructicola、M.laxa和M. fructigena中的2種或3種菌株，則同一張試紙上會出現2個以上顯色點。

圖2 MON試紙檢測原理示意圖

1.2.5 MON試紙的特異性檢測 以表1中M.fructicola、M. laxa和M. fructigena三種褐腐病菌菌株以及從進境水果上分離的陰性參照菌株Botrytiscinereal、Botryotinia fuckeliana、Botryosphaeria dothidea和Pestalotiopsis neglecta的基因組DNA為模板，用上述試紙檢測方法進行檢測，驗證MON檢測試紙的特異性。以無菌水為空白對照，平行兩次實驗。

1.2.6 MON試紙的靈敏度分析 分別取M.fructicola、M. laxa和M. fructigena三種褐腐病菌相應的標準品DNA按10倍梯度稀釋成系列濃度：100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL，各取1 μL作為模板進行不對稱PCR擴增，用上述試紙檢測方法進行檢測，分析MON試紙的最低檢測濃度。以無菌水為空白對照，平行兩次實驗。

圖3 MON試紙檢測結果判讀示意圖

1.2.7 MON試紙的多重檢測及靈敏度分析 將M.fructicola、M. laxa和M. fructigena三種褐腐病菌的標準品DNA等濃度等量混勻在單管中，按10倍梯度稀釋成系列濃度 ：100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL，各取 1 μL 作為模板進行不對稱PCR擴增，用建立的試紙檢測方法進行多重檢測及靈敏度分析。以無菌水為空白對照，平行兩次實驗。

1.2.8 MON試紙穩定性測試 將MON檢測試紙分別在4℃和37℃密封貯存，每隔30 d對不同生產批次、不同貯存溫度的試紙進行檢測能力測試，評估不同批次試紙間的檢測能力有無差異以及不同貯存溫度、不同貯存期對試紙檢測能力有無影響。

2 結果

2.1 檢測靶標DNA電泳驗證

不對稱PCR擴增所得的靶標DNA通過瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。擴增產物的電泳結果如圖4所示，PCR目標產物大約為300 bp，片段長度與預期相符。擴增所用的引物Mon F/Mon R為通用引物，非目標菌株（S11、S12、S14）DNA也可擴增產生條帶。未有擴增產物的泳道（S13、S15）或擴增條帶較弱的泳道（S2）出現引物二聚體，考慮是不對稱PCR體系中加入過量引物進行兩輪PCR擴增引起。而目標菌株DNA擴增的產物條帶清晰（S1-S10），除此之外沒有明顯的非目標擴增條帶，說明所設計的引物以及設定的PCR反應條件符合反應要求。

圖4 檢測靶標電泳圖

2.2 MON試紙的特異性驗證

MON檢測試紙對M. fructicola、M. laxa和M.fructigena三種褐腐病菌特異性驗證結果如圖5所示。3種目標褐腐病菌檢測信號點明晰，陽性信號明確不交叉，而非目標菌株以及空白對照都沒有檢測到陽性信號，質控信號正常，不存在假陽性或假陰性結果。表明MON試紙能特異性檢出M. fructicola、M.laxa和M. fructigena三種褐腐病菌。

2.3 MON試紙的靈敏度分析

分別用MON檢測試紙對菌株M. fructicola（1-42093）、M. laxa（CFCC 80293）和M. fructigena（BNCC 116805）的EF-1α重組陽性質粒DNA不同稀釋度模板進行檢測。實驗結果顯示，在100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL 的 DNA 濃度下，3種目標褐腐病菌都能被檢測到明確的陽性信號，質控信號正常，平行實驗結果一致。表明MON試紙分別對3種陽性質粒DNA的檢測靈敏度均可達到10 fg/μL。圖6展示了MON檢測試紙對最低檢測濃度10 fg/μL的標準DNA檢測結果。

圖5 水果褐腐病菌檢測試紙的特異性驗證結果

圖6 MON試紙對3種褐腐病菌最低檢測濃度驗證結果

2.4 MON試紙的多重檢測研究

MON試紙的多重檢測和靈敏度分析結果顯示：混合標準品 DNA 在 100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL濃度下均能被檢測到明顯的三重陽性信號，質控信號正常，平行實驗結果一致。表明試紙對陽性標準品DNA的多重檢測靈敏度為10 fg/μL，與單重檢測靈敏度一致。圖7展示了MON檢測試紙對最低檢測濃度10 fg/μL的混合標準品DNA檢測結果。

2.5 MON試紙穩定性測試

MON試紙儲存溫度、儲存期和批間檢測結果顯示，在4℃和37℃貯存條件下，MON試紙檢測效果沒有明顯差異，而當儲存時間達到90 d后，在10 fg/μL的標準品DNA濃度條件下，MON試紙依然保持著準確、良好的檢測能力，不同批次試紙間的檢測能力無明顯差異。圖8展示了不同貯存溫度、不同貯存時間條件下，MON試紙對10 fg/μL濃度的標準品DNA的檢測效果。

圖7 MON試紙對3種褐腐病菌的多重檢測驗證結果

圖8 MON檢測試紙穩定性測試結果

3 討論

自2005年以來，我國進境口岸檢驗檢疫部門連續每年都從進境水果中多次截獲美澳型核果褐腐病菌。2011年的疫情尤為突出，僅從美國進境水果中就檢出美澳型核果褐腐病菌50批次。由于水果褐腐病菌寄主范圍廣、傳播途徑多、對氣候條件的適應性強，其通過水果貿易進行跨國異地傳播的風險極高。而隨著水果貿易對貨物通關速度的要求不斷提高，快速、準確、簡便的檢測技術越來越為口岸植物檢疫所需要。

M. fructicola、M. laxa和M. fructigena作為水果褐腐病最重要的3種病原菌，其傳統檢驗方法是根據病菌的形態和培養特性進行分類，首次分離后可能需長達10 d才能完成整個鑒定流程［3，8]。近年隨著分子生物學技術的迅速發展，大量以PCR為基礎的技術被應用于水果褐腐病菌的快速檢測，大大提高了鑒定的速度和準確性。歐盟將常規PCR［14]和熒光PCR［24]檢測方法列入對美澳型核果褐腐病菌的檢測標準中［29]。C?té等［20]于 2004 年開發的多重PCR檢測技術也應用較廣，但因缺乏驗證數據而未被納入該標準。2015年，Riccioni等對其進行了驗證試驗并與常規PCR技術［14]進行了比較發現，多重PCR檢測靈敏度（25 pg）明顯低于常規PCR方法（0.5 pg），但也能滿足病害診斷的要求［30]。2016年，Guinet等［25]開發的多重實時熒光PCR檢測技術和Papavasileiou等［27]開發的PCR高分辨率熔解分析技術，皆能同時檢測多種水果褐腐病菌。同年，Garcia-Benitez等［26]將 van Brouwershaven 等［24]開發的實時熒光PCR檢測技術進行探針熒光基團的改進，應用于潛伏侵染期花、果的檢測。2017年，Vilanova等［28]則在 van Brouwershaven等的技術基礎上，結合疊氮溴化丙錠進行活菌的定量檢測研究。每種方法都有各自的優越性，新技術的應用是對PCR等常規檢測方法的豐富和發展。

在本研究之前，國內外尚未見檢測試紙應用于水果褐腐病菌檢測的研究報道。檢測試紙技術是將DNA雜交技術與試紙顯色技術相結合，將待測的DNA樣本經PCR擴增成為帶生物素標記的單鏈DNA，再與試紙上的探針進行雜交，結合了特異DNA樣本的探針點即帶有生物素類的標記物，經相應的酶促顯色反應就能顯出雜交信號，從而實現對分子檢測結果的直觀、可視化處理。本研究首次嘗試使用可視化試紙對3種重要的水果褐腐病菌進行快速檢測。選擇水果褐腐病菌的EF-1α基因作為靶基因。設計通用引物Mon F/ Mon R用于靶標DNA的擴增。通用引物的設計簡化了單鏈靶標擴增體系中的成分，避免了多重PCR擴增過程中引物對之間相互干擾的情況，大大提高了靶標DNA的擴增效率。設計合成特異性探針Mfcl-P、Mlx-P和Mfgn-P，以硝酸纖維素膜為載體制備成MON檢測試紙。該試紙利用探針與模板的互補關系來保證檢測方法的特異性，這一過程類似熒光定量PCR方法的探針與模板的結合過程，具有高度特異性。在所有供試菌株中，能特異性檢測出目標褐腐病菌，檢測信號點明晰，陽性信號明確不交叉，而非目標菌株以及空白對照都沒有檢測到陽性信號，質控信號正常。對3種目標菌的單重檢測和多重檢測靈敏度一致，檢出限均可達10 fg/μL。具有很高的特異性和靈敏度。

水果褐腐病菌存在復合侵染的情況，同一果實上可能同時出現兩種褐腐病菌［25，31]。本研究開發的MON試紙既能對未知樣品進行水果褐腐病3種病原菌的特異檢測，也夠快速診斷樣品中是否存在混合感染。整個檢測流程包括DNA提取、單鏈靶標擴增和試紙檢測，不超過2 h。通過單張試紙同時實現3種病菌的多重檢測，更是節約了檢測成本，提高了檢測效率，可有效降低口岸檢疫監管和貨物通關的檢測和時間成本。與常規PCR方法相比，本研究所建立的檢測試紙方法免除電泳過程，只需根據顏色變化判定即可，具有直觀、快速、操作簡便等優勢。與同樣可直接判讀結果的熒光PCR方法相比，則無需依賴昂貴的熒光試劑和設備，具有成本低廉的優勢，便于向基層口岸推廣使用。該試紙實現了口岸水果褐腐病菌可視化核酸檢測，在口岸檢疫具有很強的可操作性和適用性，為口岸水果病菌檢疫提供了一種新的思路和解決方案。

4 結論

本研究基于DNA雜交和試紙顯色技術，根據水果褐腐病菌的EF-1α基因設計通用擴增引物和特異性探針，研發出水果褐腐病菌的快速檢測試紙條，可同時檢測3種水果褐腐病菌。對該試紙的特異性、靈敏度和穩定性等參數進行評價，測試結果表明其特異強、靈敏度高、穩定性好，可以作為水果進出口口岸對該類病菌進行檢驗檢疫的高效方法。