嗜鹽菌生物合成聚羥基脂肪酸酯（PHAs）的研究進展

張夢穎 李雅慧 詹元龍 劉長莉

（東北林業(yè)大學生命科學學院；哈爾濱 150040）

聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHAs）是微生物體內(nèi)碳源和能源的貯藏物質(zhì)，當碳源豐富而其他營養(yǎng)元素（N/P/S 等）不足時，會在不同的微生物體內(nèi)合成［1-3]。截至目前，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了約150種不同的PHA單體，并且新的單體還在不斷地發(fā)掘中［4]。PHA單體結構的多樣性主要區(qū)別于C-3位上側(cè)鏈基團的不同，其中單體碳原子數(shù)3-5是短鏈PHA（SCL PHA），碳原子數(shù)在6以上是中長鏈PHA（MCL PHA）。PHA的結構通式如圖1所示，R可以是烯基、苯環(huán)和烷基等，通常m為1，n表示聚合度，決定聚合物分子量大小［5-6]。以側(cè)鏈為甲基的聚3-羥基丁酸（PHB）最為常見。聚3-羥基丁酸（PHB）具有與聚丙烯類似的熱塑性，并具有脆性和較差的熱穩(wěn)定性；聚羥基丁酸-co-羥基戊酸共聚物（PHBV）與PHB相比，具有更好的強度、硬度，更大的彈性，更低的熔點［7-8]。短鏈PHA呈現(xiàn)出的是硬結晶體；中長鏈PHA是有熱塑性的彈性體，柔韌性好、硬度低，結晶速率慢，熔融溫度大多保持在39-61℃范圍內(nèi)［8-10]；短鏈中長鏈共聚的PHA（SCL-MCL PHA），通過調(diào)整單體比例，得到結合短鏈和中長鏈優(yōu)異性能的共聚PHA材料［10]。嗜鹽菌（Halophiles），是可以生活在高鹽度環(huán)境中的菌株，自1972年Kirk和Ginzburg首次提出嗜鹽菌積累PHA［11]，越來越多可生物合成PHA的嗜鹽菌被發(fā)現(xiàn)。

為了使PHA的生產(chǎn)達到規(guī)模化，科研工作者從多方面試驗。目前微生物發(fā)酵法是生物合成PHA的主要途徑，合成PHA的微生物主要分為3類：純菌、工程菌和混合菌。在生物合成PHA過程中，存在滅菌成本高、高淡水消耗、不連續(xù)發(fā)酵易污染等缺點，導致工業(yè)生物技術與化學工藝相比競爭力較低［12]。由于嗜鹽菌能夠在較高溫度、高pH、高NaCl濃度下正常生長，在無滅菌條件、連續(xù)發(fā)酵情況下無雜菌污染，且固定資本的投資低，可進行工業(yè)化持續(xù)生產(chǎn)［12]，又可通過細胞裂解回收聚合物，既簡化處理技術又降低成本［13-14]，并且，基因工程改造已經(jīng)開發(fā)了嗜鹽菌的方法，利用分子生物學手段提高PHA產(chǎn)量。因此，開發(fā)嗜鹽菌生物合成PHA的研究有重要的意義。本文結合課題組前期的研究工作，綜合國內(nèi)外最新研究動態(tài)，對嗜鹽菌生物合成PHA的研究現(xiàn)狀進行闡述，并對今后的發(fā)展動態(tài)進行展望。

圖1 PHA的結構［5]

1 嗜鹽菌的生物特性及分類概述

嗜鹽菌又被稱為需要鹽（NaCl）生長的微生物，可在真核生物、古菌及細菌3個不同的領域探尋到嗜鹽微生物的身影［15]。嗜鹽菌遍及在地球上各種高鹽的地理區(qū)域，如鹽湖、鹽沼和鹽田等［16]。研究表明，嗜鹽菌可以從不同層面進行分類。Kushner等通過嗜鹽微生物對鹽濃度的不同需求，將其分為輕度嗜鹽菌、中度嗜鹽菌、邊緣極端嗜鹽菌、極端嗜鹽菌及非嗜鹽菌5類［13]，這是相對較早且較細化的分類方式；Oren等又根據(jù)嗜鹽菌生長最佳鹽濃度的不同，將嗜鹽菌大致分為中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌［14]；Quillaguamán等［15]在原有分類基礎上，將嗜鹽微生物概括為：弱嗜鹽微生物，中度嗜鹽微生物（NaCl 3%-15%，W/V）和極端嗜鹽微生物（NaCl 15%以上，W/V）［16]。盡管分類數(shù)目不同，但定義各類別嗜鹽菌適宜的鹽濃度范圍大致相同，如中度嗜鹽菌的最適生長鹽濃度為0.5-2.5 mol/L；極端嗜鹽菌的最適生長鹽濃度為 2.5-5.2 mol/L［17]。

在高鹽高滲透壓下，嗜鹽菌具有可以適應的生存機制。第一種機制是積累無機離子（主要是KCl）以平衡滲透壓；第二種機制是積聚低分子量的水溶性有機化合物，作為相容溶質(zhì)或滲透劑，保持細胞內(nèi)低的鹽濃度［18-19]。這兩種機制的存在促使嗜鹽菌可區(qū)別于普通菌在高鹽環(huán)境下正常生長。

2 嗜鹽菌生物合成PHA的分類

2.1 野生型嗜鹽菌生物合成PHA

在嗜鹽菌的純菌種生物合成PHA的研究中，研究者從自然界分離、純化可產(chǎn)PHA的嗜鹽菌，然后在不同條件下進行產(chǎn)PHA實驗。在碳源豐富、氮源限制營養(yǎng)不均衡的條件下，極端嗜鹽古菌Halobacterium mediterranei和H. volcanii.可積累PHA；而嗜鹽小盒菌屬marismortui在營養(yǎng)充足的培養(yǎng)基上，積累的PHA占細胞干質(zhì)量的21%。當H.halophila在適宜的鹽濃度（NaCl 60 g/L）下，PHA合成量高達3.68 g/L，占細胞干質(zhì)量的82%［20]。極端嗜鹽古菌Natrinema ajinwuensisRM-G10在利用發(fā)酵罐分批重復培養(yǎng)72 h，PHA積累量占細胞干質(zhì)量的61%［21]。嗜鹽菌的純菌種生物合成PHA，是開發(fā)其基因工程菌的研究基礎。相對生活在中性環(huán)境下可產(chǎn)PHA的微生物，嗜鹽菌的純菌種在工業(yè)生產(chǎn)中避免雜菌污染可降低生產(chǎn)成本，使嗜鹽菌在和其他微生物的競爭中占有優(yōu)勢，這也是很多學者不斷開發(fā)利用嗜鹽菌生物合成PHA的原因。

2.2 嗜鹽菌的基因工程菌生物合成PHA

在嗜鹽菌合成PHA的過程中，有很多基因起著至關重要的作用，如Tan等［22]敲除鹽單胞菌TD01的phaP基因?qū)е翽HB的合成量下降（由88%下降至72%），敲除phaC1基因又使其喪失合成PHB的能力，這些基因都直接影響PHB的產(chǎn)量。因此，與PHA合成相關的基因被認為是工業(yè)生產(chǎn)中有前途的候選基因［12，23]。運用基因工程技術，構建嗜鹽菌的工程菌，敲除抑制或降解PHA合成的相關基因，過表達促進PHA合成的相關基因［22]，嘗試通過分子生物學技術降低PHA的生產(chǎn)成本，提高PHA的產(chǎn)量。

野生型H. campaniensisLS21以模擬的廚房廢物為底物合成PHA，PHA的積累量占細胞干重的26%；然而將基因phbCAB重組到野生菌H.campaniensisLS21中，構建其工程菌，PHA的積累量占細胞干質(zhì)量的70%［24]；Fu等［25]通過敲除鹽單胞菌TD01中編碼2-甲基檸檬酸合酶的基因，使得PHA的共聚物PHBV的產(chǎn)量占細胞干質(zhì)量的70%。

Tan等［22]以TD01為出發(fā)菌株，成功地開發(fā)了采用未滅菌、連續(xù)發(fā)酵的方式生物合成PHA的平臺。為提高該平臺的穩(wěn)定性，部分地抑制鹽單胞菌TD01的DNA甲基化系統(tǒng)，構建具有高拷貝數(shù)、穩(wěn)定的、共軛的質(zhì)粒pESVA131，以包含Laclq-Ptrc系統(tǒng)，從而實現(xiàn)多途徑基因的誘導表達；又通過使鹽單胞菌TD01染色體內(nèi)缺失2-甲基檸檬酸合成酶和3個PHA解聚酶，構建出新型嗜鹽菌株TD08，蘇氨酸合成途徑中的蘇氨酸脫氫酶的過表達使重組鹽單胞菌TD08能夠產(chǎn)生聚（3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯）或PHBV。細胞分裂抑制劑MinCD在鹽單胞菌TD08細胞生長的穩(wěn)定期過表達時，導致細胞的長度較原始長1.4倍，PHB積累量從69 wt% 增加到 82 wt%，這在提高PHA產(chǎn)量的同時也會誘導細胞沉淀，簡化產(chǎn)物的下游處理工藝。Chen等又通過將編碼4-羥基丁酸酯輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因orfZ整合到野生型Halomonas bluephagenesisTD01中，構建出TD01的又一基因工程菌，新構建的工程菌在開放的非無菌條件下，以葡萄糖和 γ-丁內(nèi)酯為碳源的培養(yǎng)基上，產(chǎn)生聚（3-羥基丁酸酯-4-羥基丁酸酯）共聚物；在1000 L的發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)時，48 h內(nèi)共聚物的細胞干重為83 g/L，PHA積累量占細胞干質(zhì)量的 61%［26]。

綜上所述，我們能清晰地看到嗜鹽菌的工程菌株高產(chǎn)PHA的潛力。但又因適于鹽單胞菌科的高效轉(zhuǎn)化方法是接合轉(zhuǎn)化，在嗜鹽菌構建基因工程菌方面，需針對特定的細菌，調(diào)整供體-受體菌比例，明確接合時間，優(yōu)化復蘇培養(yǎng)基，才更適于嗜鹽菌基因工程菌的構建與優(yōu)化［27]。因此，在野生型嗜鹽菌的基礎上，通過先進的分子生物學技術，構建工程菌，從而大幅度提高PHA的合成量，是有價值、有潛力的研究方向。

3 嗜鹽菌生物合成PHA的影響因素

3.1 發(fā)酵條件對嗜鹽菌生物合成PHA的影響

嗜鹽菌多是專性好氧化能異養(yǎng)型［28]，在PHA合成過程中，搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)都會提供充足的氧氣，即保持高轉(zhuǎn)速（160-210 r/min）下培養(yǎng)［20，22，24，29]。Wang 等［29]從大慶地區(qū)的鹽堿土壤中篩選出嗜鹽細菌Halomonassp. DQ-4，500 mL的錐形瓶裝液量為100 mL時，搖瓶培養(yǎng)48 h，PHA產(chǎn)量達4.3 g/L，而當裝液量為200 mL時，PHA產(chǎn)量僅為2.76 g/L。Chen課題組使用500 L發(fā)酵罐，300 L的工作體積，培養(yǎng)基的起始葡萄糖25 g/L，NH4Cl33 g/L，尿素2 g/L，在37℃、空氣流速1.5 m3/h、pH維持在8.5-9.0的條件下，細胞干重達83 g/L，PHB含量占細胞干重的80%［22，26]。綜上，在嗜鹽菌生物合成PHA過程中，依據(jù)實驗中所涉及菌株的生長特性，通過發(fā)酵條件優(yōu)化，將可高產(chǎn)PHA的條件確定為最適合本菌株的發(fā)酵條件，這既保證嗜鹽菌最好的生長狀態(tài)，又能提高 PHA 的產(chǎn)量［20，22，26，29]。目前，本實驗室也在探究發(fā)酵條件對嗜鹽菌生物合成PHA的影響，經(jīng)初步實驗分析，在最適的溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量、pH、培養(yǎng)溫度等發(fā)酵條件下，可以提高PHA的合成量。

3.2 NaCl濃度對嗜鹽菌生物合成PHA的影響

嗜鹽菌為維持細胞壁的完整性需要在高鹽的環(huán)境下生存［30]。NaCl的濃度不僅為維持細胞壁完整性，影響PHA的合成量，而且對PHA聚合物的分子量（Mw）和熱性能（Tm，Td）也有影響；不同濃度的NaCl，熔融溫度（Tm）越高分解溫度（Td）越低［20，32]，但總體而言，不同濃度NaCl產(chǎn)生的PHA樣品的分解溫度（Td）在247-262℃之間，熔融溫度（Tm）都在180℃左右（表1），這與Koller提出的由其他有機體產(chǎn)生的高分子量PHA樣品的Tm值在 180℃左右相對應［20，31]。

嗜鹽革蘭氏陽性桿菌Bacillus megateriumuyuni S29在0.5% 的 NaCl下，PHA合成量為 1.17 g/L；4.5%的NaCl下，PHA合成量為2.22 g/L；10% 的NaCl下，PHA 合成量為 0.72 g/L［32]。Halomonas halophila在 6%的NaCl下，PHA合成量為3.68 g/L；10% 的NaCl下，PHA合成量為1.48 g/L。因此，不同的嗜鹽菌其最適NaCl濃度不同，NaCl的濃度能直接導致PHA合成量不同。所以，由嗜鹽菌生物合成PHA時，探究最適的NaCl濃度是必要的。

表1 H. halophila在不同NaCl濃度下所產(chǎn)的PHA物理性質(zhì)和分子量［20]

Halomonas halophila在 2% 的 NaCl下， 合 成PHA聚合物的熱穩(wěn)定性最高，10% 的NaCl下，聚合物熱穩(wěn)定性較低，Td值浮動在3.8-14.2℃間（見表1）。我們在利用嗜鹽菌生物合成PHA過程中，調(diào)節(jié)NaCl的濃度，可以控制聚合物的分子質(zhì)量，如H. halophila在低的鹽濃度下（2%或4%），生物合成的PHA分子量較其在高鹽度下低；在較高的鹽度下（6%、8%或10%），會產(chǎn)生高分子量的聚合物［3]。因此，NaCl濃度對嗜鹽菌生物合成PHA的熱穩(wěn)定性和分子量有一定影響。

綜上，嗜鹽菌作為出發(fā)菌株進行產(chǎn)PHA實驗時，產(chǎn)物的結晶度（Xc）、熔融溫度（Tm）、分解溫度（Td）影響著未來成品的耐熱性、耐低溫性、耐沖擊性、成型性等。選擇最適的鹽濃度，既避免鹽添加的過多或不足，又可獲得產(chǎn)量高、材料性能好的PHA［3，20]。

3.3 不同碳源對嗜鹽菌生物合成PHA的影響

碳源作為PHA合成過程中必不可少的營養(yǎng)元素，隨著對嗜鹽菌合成PHA研究的深入，截至目前發(fā)現(xiàn)，嗜鹽菌可利用鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、木質(zhì)纖維素、糖蜜及羧甲基纖維素鈉等作為碳源［20，29，33]。其中，H. halophila以鼠李糖為碳源時，PHA 產(chǎn)量是 4.98 g/L［29]。H. halophila雖不能直接利用乳糖，但可利用經(jīng)酸催化水解后產(chǎn)生的干酪乳清作為碳源，其PHA的積累量達3.26 g/L。此外，嗜鹽菌還可利用鋸末（SWD）和玉米秸稈（CS）的水解產(chǎn)物，而玉米秸稈的水解產(chǎn)物在稀釋一次后作為基底物，細菌生長不良、PHA無積累；再經(jīng)二次稀釋后，出現(xiàn)良好的生物質(zhì)和PHA效價［23-34]。利用玉米秸稈作為碳源時，通過簡單稀釋水解產(chǎn)物就可以很容易被嗜鹽菌利用。因此，嗜鹽菌是一個強大的細菌菌株，在未來的工業(yè)化生產(chǎn)中，有不可忽視的優(yōu)勢。

雖然葡萄糖是最好利用、最易轉(zhuǎn)化的糖類，但在實驗中，當生物體利用葡萄糖時，就發(fā)現(xiàn)對其他糖的零利用；相反，在以其他碳源取代葡萄糖的條件下，不同的糖以相同速率消耗的或多或少，如當以鋸末水解物代替葡萄糖時，嗜鹽菌會優(yōu)先利用木糖［20]。

廉價碳源的開發(fā)利用，我們看到了嗜鹽菌的發(fā)展?jié)摿ΑＴ诮档偷孜锍杀镜耐瑫r，又減少環(huán)境污染。采用最優(yōu)的方式處理可再利用的廢物，減少資源占地空間，避免資源浪費。在我國東北地區(qū)，玉米秸稈可謂是遍地可見，焚燒處理會污染空氣，浪費資源。而上文提及的經(jīng)簡單的二次稀釋，玉米秸稈可被嗜鹽菌再利用進行生物合成PHA［20]。這一辦法的實施，秸稈被有效利用，避免處理過程中污染環(huán)境；又生物合成PHA，這在廢物再利用的同時又創(chuàng)造出新的生物資源。

4 結語

當微生物處于營養(yǎng)不均衡的條件下，作為儲備碳源而在細胞內(nèi)聚集積累的高分子生物聚酯，即聚羥基脂肪酸酯。PHA作為生物塑料，其推廣式生產(chǎn)應用，將節(jié)約石化資源，減少環(huán)境污染，實現(xiàn)資源的可持續(xù)發(fā)展。隨著對PHA研究的深入，嗜鹽菌作為可產(chǎn)PHA的菌株已成為國內(nèi)外研究的熱點。

由嗜鹽菌作為出發(fā)菌株進行生物合成PHA的實驗，其優(yōu)勢有：（1）嗜鹽菌適宜生長在高鹽高堿的環(huán)境，這在菌的發(fā)酵實驗中省略了繁瑣復雜的滅菌過程，可降低生產(chǎn)成本；（2）在可產(chǎn)PHA的野生型嗜鹽菌的基礎上，嘗試通過分子生物學手段來提高PHA的合成量，是有價值、有潛力的研究方向；（3）對于不能進行產(chǎn)PHA的野生型嗜鹽菌，嘗試通過分子生物學手段進行產(chǎn)PHA實驗。

自嗜鹽菌產(chǎn)PHA被發(fā)現(xiàn)至今，已有將近50年，嗜鹽菌作為較其他產(chǎn)PHA的菌株，研究仍較少，這可能與其在生長過程中最適碳源的選擇、氮源的添加以及工程菌株構建方面的培養(yǎng)條件還不完善等方面有關。但是，隨著科學技術的發(fā)展進步，生物研究方法的更新?lián)Q代，由嗜鹽菌生物合成PHA的形態(tài)、分子量、動力學參數(shù)和生物技術特性等研究可能會帶給我們很多意外收獲。綜上所述，嗜鹽菌作為產(chǎn)PHA的優(yōu)勢種，其有著菌株本身的優(yōu)勢，也有很多待探究的優(yōu)勢。因此，我們對由嗜鹽菌作為出發(fā)菌株進行產(chǎn)PHA的實驗應抱有持續(xù)關注的態(tài)度，積極探究的好奇心，從而促使嗜鹽菌在生物塑料合成及其他副產(chǎn)品開發(fā)等方面有更加顯著的成果。