冠心病病人血漿中相關炎性因子水平及其與TIPE2的關系研究

冠心病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的簡稱，是臨床常見的心腦血管疾病[1]。目前，冠心病的發病機制尚未完全明確，但是已經有研究證實單核細胞趨化因子（MCP-1）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、可溶性血管內皮細胞間黏附分子1（sVCAM-1）、 白細胞介素 1（IL-1）、IL-6、IL-8 等炎性因子與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關[2]。TIPE2是2008年發現的一種新型抗炎蛋白，能夠通過抑制炎癥反應而對動脈粥樣硬化發揮抑制作用[3]。本研究旨在觀察冠心病病人血漿中相關炎性因子水平及其與外周血單個核細胞（PBMCs）中TIPE2之間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2016年1月至2018年6月于我院收治的50例冠心病病人為觀察組，其中男37例，女13例，年齡 54～78歲，平均（62.42±8.66）歲；隱匿性冠心病9例，心絞痛27例，心肌梗死8例，心力衰竭及心律失常6例。納入標準[4]：（1）經冠脈造影顯示，任意一支冠狀動脈管腔面積狹窄超過50%的病人；（2）來診前3個月未給予糖皮質激素治療的病人；（3）對本次研究知情同意。排除標準[5]：（1）未給予冠脈造影檢查的病人；（2）合并急慢性炎癥的病人；（3）合并瓣膜性心臟病的病人；（4）過敏性體質病人；（5）合并腫瘤以及癌前病變的病人；（6）合并免疫性疾病病人；（7）合并過敏性疾病的病人；（8）合并潰瘍性結腸炎的病人。另選擇同一時期至我院進行健康體檢的健康人員50例作為對照組，其中男31例，女19例，年齡50～80歲，平均（63.77±8.29）歲。 2組病人性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已通過醫院倫理委員會審核批準。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集：觀察組病人在行冠脈造影前取清晨空腹靜脈血3 mL，采血管為肝素抗凝管，使用離心機3000 r／min離心15 min，吸取下層紅細胞，將剩余血液再次離心后，吸取上部大部分血漿，于-80℃冰箱中保存備用。行冠狀動脈造影的同時取動脈血3 mL，加入淋巴細胞分離液進行分離，吸取中間白膜層即為PBMCs，行TIPE2 mRNA檢測。對照組在體檢時采集清晨空腹靜脈血3 mL、橈動脈血3 mL，采集方法同觀察組。

1.2.2 炎性因子檢測：采用酶聯免疫吸附試驗法檢測血漿中 MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8的含量。相關試劑盒均購自R＆D公司，均由我院生化實驗室進行檢測，檢測過程嚴格按照試劑盒說明書要求操作。采用美國公司生產的全自動酶聯檢測儀檢測樣品的吸光度，根據標準曲線和標準公式計算樣品濃度。

1.2.3 TIPE2 mRNA檢測：采用 RT-PCR法檢測TIPE2 mRNA水平。Trizol購自美國Gibco BRL公司，Taq酶購自大連寶生物公司，模板 RNA 2μg、MMLV逆轉錄酶購自美國Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成。采用Trizol法提取組織總RNA，反應條件為95℃預變性5 min，94℃ 1 min，68℃ 30 s，72℃ 40 s，共計 29個循環，72℃延伸 10 min。PCR反應產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min，使用UVIpro凝膠圖像分析系統（美國KODAK公司）進行攝像、掃描、分析。所有操作嚴格按照說明書進行。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件處理分析研究中的所有數據，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料以百分（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Pearson相關系數分析TIPE2 mRNA的相對表達量與相關炎性因子表達水平之間的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組相關炎性因子表達情況 觀察組病人MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 的表達水平均明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。 見表 1。

表1 2組相關炎性因子表達情況（±s，n＝50）

表1 2組相關炎性因子表達情況（±s，n＝50）

注：與對照組比較，??P＜0.01

炎性因子 對照組 觀察組MCP-1（pg／mL） 102.47±8.22 135.72±20.56??MMP-9（pg／mL） 114.29±10.28 176.39±25.47??TNF-α（mg／mL） 20.03±2.94 25.33±5.12??sVCAM-1（pg／mL） 92.33±11.58 149.36±30.27??IL-1（pg／mL） 21.50±4.29 42.33±10.44??IL-6（pg／mL） 11.29±2.53 18.44±4.07??IL-8（pg／mL） 31.40±6.16 41.05±6.81??

2.2 2組TIPE2 mRNA的相對表達量比較 觀察組TIPE2 mRNA相對表達量為16.29±1.57，明顯低于對照組的21.33±1.37，差異具有統計學意義（t＝17.103，P＜0.001）。2組凝膠電泳圖見圖1。

圖1 2組TIPE2凝膠電泳圖

2.3 TIPE2 mRNA的相對表達量與炎性因子的相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示，TIPE2 mRNA的相對表達量與 MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8的表達水平均呈負相關，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。 見表2。

表2 TIPE2 mRNA的相對表達量與炎性因子的相關性分析

3 討論

冠心病是臨床常見的心血管疾病，隨著人類飲食結構的變化，冠心病發病率呈現逐年升高的趨勢[6]。病人以心前區壓榨性疼痛為主要臨床癥狀，發作時可伴隨呼吸急促、大汗淋漓、嘔吐甚至昏厥，具有較高的致死率，嚴重的冠心病可對病人的生存質量造成重大影響，并帶來嚴重的經濟負擔。有數據統計發現，2009年中國城市居民冠心病死亡率為94.96／10萬，農村為71.27／10萬[7-8]。因此冠心病的治療和預防成為臨床研究的重要課題之一。

冠心病的病因尚未完全明確，但臨床認為炎癥因子在疾病的發生和發展過程中起到重要作用[9]。MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 等炎性因子已經證實與冠心病密切相關[10]。MCP-1屬于趨化因子CC家族，主要在血管平滑肌細胞、血管內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞中表達，能夠與趨化因子受體相結合，通過細胞膜上特有的信號通路激活單核細胞或巨噬細胞，從而參與動脈粥樣斑塊的一系列炎性反應。MMPs屬于內肽酶家族，具有鋅離子依賴的特性[11]。MMPs是人體內降解細胞外基質的主要酶類，能夠對腫瘤周邊細胞所構成的屏障進行降解，從而破壞細胞間的黏附力。MMP-9屬于MMPs中的明膠酶，被稱為明膠酶B，具有降解明膠的作用，因此在粥樣斑塊的發生中起到重要作用。TNF-α是由單核細胞和巨噬細胞合成的，具有多種生物學功能，在免疫功能調節和炎癥反應中具有重要作用，而且能夠通過觸發細胞因子之間的級聯反應促使粥樣硬化的形成和發展[12]。sVCAM-1大量存在于血液中，可促進炎癥細胞與血管內皮細胞黏附，引發血管內皮損傷，誘導血管收縮，增加心臟缺血缺氧。研究已經證實sVCAM-1水平與遠期心血管不良事件的發生率呈正相關[13]。IL-1也稱為淋巴細胞刺激因子，主要由活化的單核-巨噬細胞產生，能夠通過促進B細胞的增殖和分泌抗體發揮免疫調節作用。IL-6主要由單核-巨噬細胞、Th2細胞、血管內皮細胞等產生，能夠分別刺激B細胞和T細胞活化，通常刺激肝細胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應[14]。IL-8主要由單核-巨噬細胞產生，其他細胞能夠在適宜的刺激條件下產生少量，已經證實在冠心病的炎癥發展中具有重要作用。

TIPE2是一種新型的抗炎蛋白，屬于TNF-α誘導蛋白8家族，研究發現TIPE2能夠通過對T細胞受體和T細胞TOLL樣受體信號途徑進行負向調節，從而起到負性調控作用，以此維持機體內環境的穩定性，實現機體的免疫耐受。由于TIPE2是在2008年才發現的新型蛋白，其研究較少，雖然已經證實其在維持免疫穩態中的作用以及在抗動脈粥樣硬化過程中的作用，但是與冠心病病人血漿中相關炎性因子關系的研究較少。從本次研究來看，觀察組病人 MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 的表達水平均明顯高于對照組（P＜0.01），說明上述炎癥因子在冠心病的發生發展過程中具有重要意義。觀察組TIPE2 mRNA相對表達量明顯低于對照組（P＜0.05），這是因為TIPE2是通過核因子（NF）-κB信號通路維持炎性細胞因子和抗炎因子的平衡，健康人群中二者平衡比較穩定，因此TIPE2水平較高，但是冠心病病人中這一平衡被打破，炎癥因子水平明顯升高，TIPE2水平降低。相關分析發現TIPE2的相對表達量與MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 的表達水平均呈負相關（P＜0.05或P＜0.01），說明 TIPE2具有抑制病人相關炎癥因子的作用。這是因為TIPE2能夠通過抑制TLR和T細胞受體的表達減少NF-κB的激活，而后者的激活是炎性因子釋放和分泌的必要途徑，因此TIPE2能夠抑制炎癥的發生，所以在本次研究中TIPE2與各種炎性因子均呈現出負相關。

綜上所述，冠心病病人血漿中相關炎性因子與PBMCs中TIPE2的表達呈負相關，TIPE2能通過抑制相關炎性因子的表達起到抗冠狀動脈粥樣硬化的作用，但是本次研究樣本量較小，后續仍需要大量研究來探討TIPE2在冠心病中的作用機制，從而為冠心病的預防和治療提供新途徑。