分子印跡聚合物固相萃取黃毛耳草中熊果酸

邢占芬，成洪達*，張平平，王清路

1. 齊魯醫藥學院藥學院（淄博 255213）；2. 齊魯醫藥學院生物醫學工程技術重點實驗室（淄博 255213）

熊果酸為三萜類物質，是一種用途廣泛的食品添加劑，同時熊果酸具有很強的生物活性，在臨床上可用于癌癥、高血脂、潰瘍、糖尿病等疾病的治療[11-13]。熊果酸來源很廣，可以從多種植物中提取，如黃毛耳草、女貞子、冬凌草、車前草、枇杷葉等。

分子印跡技術具有鎖鑰結構特點，對預定分子有很高的選擇性和卓越的識別性能，具有分離效率高、穩定性好、消耗溶劑少等特點[1-3]。基于其優良的性能，分子印跡技術已廣泛用于天然藥物有效成分分離、傳感器分子識別、色譜層析固定相和藥物傳遞等領域[4-7]。固相萃取技術是一項高效的分離富集技術，將分子印跡聚合物用作固相萃取填料，可有效將印跡技術的特異性吸附和固相萃取卓越的分離效率相結合，提高分離萃取能力[8-10]。

試驗將通過紅外光譜分析，制備熊果酸印跡聚合物，考察其特異性吸附能力，將印跡聚合物與固相萃取技術相結合用于黃毛耳草中熊果酸的分離與富集。

1 儀器、設備與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀（IR Prestige-21，日本島津公司）、電子天平（FA 1004 N，上海精密科學儀器有限公司）、高效液相色譜儀（LC-20 A，日本島津公司）、電熱恒溫水箱（CU 600，精慧智能儀表公司）、紫外可見分光光度計（UV 2550，日本島津公司）、數控超聲波清洗機（WTY 600，超聲功率600 W，頻率28 kHz，萬通超聲儀器設備廠）、臺式恒溫振蕩儀（THZ-22，江蘇太倉市實驗設備廠）、固相萃取裝置（57044，Supelco）。

黃毛耳草（安國市云天中藥行）、熊果酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號Z110742）、丙烯酸（AC，上海譜振生物科技有限公司）、偶氮二異丁腈（AIBN，上海譜振生物科技有限公司）、4-乙烯基吡啶（4-VP，百靈威科技有限公司）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA，百靈威科技有限公司）、丙烯酸（天津市興復精細化工研究所）、四氫呋喃（天津市康科德科技有限公司）、甲醇（天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為二次蒸餾水。

2 試驗內容

2.1 聚合物的制備

精密稱取0.01 g熊果酸于1.50 mL四氫呋喃中，超聲使模板分子溶解，加入6.00 μL丙烯酸、83.00 μL乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.03 g偶氮二異丁腈，超聲混合，通氮氣，密封，放入恒溫水浴箱反應12 h。取出聚合物粉碎，過120目篩，甲醇索式提取6 h，恒溫干燥90 min即得印跡聚合物（MIP）。

同樣方法制備空白聚合物（NIP）。

2.2 靜態吸附試驗

稱取40 mg MIP及NIP，各9份，分別加入不同濃度熊果酸甲醇溶液（濃度1～9 mmol·L-1），室溫振蕩平衡6 h，離心30 min，取適量上層清液，測定平衡溶液吸光度。用式（1）計算聚合物吸附量（Q），考察聚合物吸附性能。

式中：C0為初始濃度，mmol·L-1；C為吸附濃度，mmol·L-1；V為溶液的體積，mL；m為聚合物質量，mg。

2.3 吸附選擇性試驗

分別以熊果酸相似物白樺脂酸、羽扇豆醇為底物（結構見圖1），考察熊果酸印跡聚合物吸附選擇性能。以乙腈為溶劑，配制0.2 mmol·L-1白樺脂酸、羽扇豆醇溶液，測定其紫外吸光度，計算吸附前后溶液濃度及聚合物對各底物的吸附量。

圖1 結構式

2.4 分子印跡固相萃取黃毛耳草中的熊果酸

2.4.1 固相萃取柱的制備

取一根商品固相萃取柱（1 mL，100 mg），倒出吸附劑，柱體及濾板用甲醇超聲洗滌，稱取0.10 g的熊果酸聚合物加入柱中，用20 mL甲醇充分潤濕平衡。

2.4.2 黃毛耳草粗提液的制備

將黃毛耳草晾曬干燥，粉碎，稱取10 g粗粉，用200 mL乙醇索氏提取2 h，過濾后濃縮至干，甲醇溶解即得。

2.4.3 黃毛耳草中熊果酸的萃取分離

將1 mL黃毛耳草提取液加入固相萃取柱中，用5 mL甲醇淋洗，5 mL甲醇-乙酸（8:2，V/V）溶液洗脫，流速為0.3 mL·min-1。流出液均干燥后用甲醇溶解，HPLC分析。分析條件：Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流速1.0 mL·min-1，檢測波長210 nm，流動相為甲醇-水。

3 結果與討論

3.1 紅外光譜試驗

由圖2可知，紅外光譜中有羥基強峰（3 528 cm-1）、羧酸羰基（1 717 cm-1）、—CH3強峰（2 956 cm-1）和—CH2峰（2 922 cm-1）；并展示出熊果酸的典型結構吸收峰，包括兩個基本骨架特征，即：熊果酸A區1 441，1 367和1 363 cm-1；熊果酸B區1 304，1 272和1 252 cm-1。聚合物的紅外譜圖在3 000 cm-1處的烷烴峰明顯減弱，在3 528 cm-1處的—OH峰明顯減弱，在1 717 cm-1處的—C==O峰也明顯減弱，表明熊果酸的羰基與羥基均參與了反應；從圖2中還可以看出，由于形成了新的聚合物，熊果酸典型結構吸收有所減弱或合并。圖3為印跡過程示意圖。

圖2 熊果酸（a）、熊果酸聚合物（b）紅外光譜

圖3 印跡過程示意圖

3.2 印跡聚合物吸附等溫線

如圖4所示，MIP吸附曲線呈先快速增加后趨于平衡的結合特點，在測定濃度范圍內，MIP對熊果酸的吸附量均遠遠大于NIP對熊果酸的吸附量。這表明與空白聚合物比較，所制備MIP對熊果酸具有更好的吸附性能，體現出良好的特異性吸附特點。

3.3 印跡聚合物吸附選擇性

為進步一研究熊果酸分子印跡聚合物的吸附特性，使用了與熊果酸分子結構相似的羽扇豆醇、白樺脂酸作為對照品，分別測定了熊果酸印跡聚合物對二者的吸附量，由結果可看出，熊果酸印跡聚合物對熊果酸分子的吸附量遠遠大于對羽扇豆醇和白樺脂酸的吸附量，表現出良好的鎖鑰特點。同時可以看出，由于白樺脂酸與熊果酸結構更相似，其吸附量大于羽扇豆醇。用a、ε參數進一步說明結合特點，a為印跡聚合物和空白聚合物對熊果酸吸附量之比，其值越大，聚合物吸附效果越好；ε為印跡聚合物對熊果酸和對照品吸附量之比，值越大，聚合物吸附選擇性越好。由結果可知，熊果酸a為2.76，表示印跡聚合物具有良好的印記效果，相對于羽扇豆醇和白樺脂酸的ε均大于2，表現出較好的選擇性。

3.4 黃毛耳草中熊果酸的固相萃取試驗

將所制備的熊果酸分子印跡聚合物用于黃毛耳草提取液的固相萃取。從圖5色譜圖可看出，黃毛耳草成分較為復雜，其中熊果酸含量較高。將1 mL黃毛耳草提取液加入印跡聚合物固相萃取柱，用甲醇進行淋洗，從淋洗液色譜圖可以看出，淋洗液中基本檢不出熊果酸，說明印跡聚合物已將熊果酸選擇性吸附，熊果酸未進入淋洗液；淋洗完畢，用乙酸、甲醇混合溶液對印跡聚合物萃取柱進行洗脫，洗脫液中已無其他物質，只檢出熊果酸。從分析結果可看出，制備的熊果酸分子印跡聚合物對熊果酸具有明顯的特異性吸附，吸附性能良好，可用于固相萃取填料實現對黃毛耳草中熊果酸的分離與富集。

圖4 聚合物對熊果酸吸附量

表1 聚合物對底物的選擇性

圖5 色譜圖

4 結論

以丙烯酸為單體，在乙二醇二甲基丙烯酸酯交聯作用下合成了熊果酸分子印跡聚合物，經過紅外光譜分析驗證了其結構，通過靜態吸附試驗及選擇性能測試考察了聚合物對熊果酸的特異性吸附能力，結合固相萃取技術對黃毛耳草提取液進行了進一步的分離；結果表明，所制備的熊果酸分子印跡聚合物結構穩定，對熊果酸具有較強的特異性選擇吸附性能，作為固相萃取吸附劑，可有效地對黃毛耳草中熊果酸進行分離與富集。基于特異性識別性強、選擇性高、成本低等特點，熊果酸分子印跡聚合物與固相萃取、液相色譜等技術相結合，可廣泛應用于中藥材中熊果酸的提取、樣品中痕量熊果酸富集與分析等領域，具有廣闊的應用前景。