酶解對紫花蕓豆清蛋白功能性質的影響

林巍，翟麗萍，劉曉蘭，孫美佳

齊齊哈爾大學食品與生物工程學院（齊齊哈爾 161006）

蕓豆是豆科菜豆屬小宗雜糧，是世界上主要栽培的豆類作物之一。我國蕓豆種植面積廣，產量高，品種資源豐富。黑龍江省是我國蕓豆的主要產區之一，年出口總量占全國的近1/2[1]。蕓豆富含淀粉、蛋白質、多糖、膳食纖維、花色苷等物質，其中蛋白含量達20.29%～27.73%，包括清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白等，其中清蛋白含量最高[2]；蕓豆清蛋白中含有18種氨基酸，氨基酸總量達85.30%，其中谷氨酸含量最高，其次是天門冬氨酸，氨基酸比例合理，具有較高營養價值[3]。但是目前蕓豆蛋白利用率相對較低，主要因為其分離蛋白具有相對較差的功能特性，限制了這類蛋白資源在食品加工中的應用。研究表明蕓豆蛋白酶水解后會改善其功能性質[4-5]，釋放特殊的生理活性，如抗氧化活性[6-8]。蕓豆是一種潛在的優質豆類蛋白資源，因此，試驗主要對酶解前后紫花蕓豆清蛋白的功能性質變化情況進行了研究，為蕓豆蛋白在食品工業上的應用奠定基礎，也為蕓豆資源深加工產業的發展提供理論依據。

基金項目：黑龍江省省屬高等學校基本科研業務費科研項目（YSTSXK201822）；黑龍江省教育廳科研創新團隊項目（135309113）；黑龍江省教育廳基本業務專項糧頭食尾（LTSW201717）

1 材料與方法

1.1 材料與設備

黑龍江紫花蕓豆，市售，蛋白質質量分數23.77%；DPPH、ABTS，均購于Sigma公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶，購于上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶，購于上海生工；其他試劑等均為國產分析純。

T-114分析天平，美國丹佛；水浴恒溫振蕩器，上海躍進醫療器械廠；紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司；真空冷凍干燥機，美國Sim公司；CF 15 RXII高速離心機，日本日立公司；En Spire全波長多功能酶標儀，美國珀金埃爾默公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫花蕓豆清蛋白的提取

將紫花蕓豆浸泡后手工脫皮，50 ℃烘干，粉碎過篩，得蕓豆粉。1份蕓豆粉加15份蒸餾水，調節溶液pH為8，50 ℃振蕩提取3 h，冷卻后12 000 r/min離心30 min。取上清液，用鹽酸調至pH 4.8，以5 000 r/min再離心20 min。取沉淀，用pH 4.8的去離子水洗2次，pH 7水復溶，以3 000 r/min離心20 min，取上清液冷凍干燥，備用。

1.2.2 不同蛋白酶酶解效果比較

使用4種商業蛋白酶（木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶）對蕓豆清蛋白進行了酶解，通過比較水解度和水解產物中蛋白變化確定最適酶。

1.2.3 酶解前后紫花蕓豆清蛋白功能性質影響

1.2.3.1 紫外光譜掃描

缺硼：幼苗子葉和真葉發紫，葉片僵而脆。莖生長點發黑、干枯，在生長點附近長出新的側枝。整個植株呈叢生狀。頂端的枝條向內卷曲，發黃而死，葉片、葉柄及中脈都變脆。

取濃度為0.1%的木瓜蛋白酶酶解液、堿性蛋白酶酶解液和清蛋白溶液，分別在200～800 nm范圍用多功能酶標儀掃描，平行測定3組試驗。

1.2.3.2 起泡性能的測定

分別配置濃度為2%的木瓜蛋白酶酶解液、堿性蛋白酶酶解液和清蛋白溶液，各取50 mL，用均質機以10 000 r/min攪打2 min，然后測定泡沫體積，記為V1（mL）。靜置10，20和30 min之后，再次測定泡沫的體積V2（mL），記為泡沫穩定性。

1.2.3.3 乳化性能的測定

分別配置濃度為3%的木瓜蛋白酶酶解液、堿性蛋白酶酶解液和清蛋白溶液各50 mL，調節至pH 7.0，加入50 mL大豆油，再均質5 min，迅速將乳化液倒入100 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min，測量乳化層體積。上述方法所得混合液放置于80 ℃的水浴鍋中保溫30 min，冷卻至室溫后再以3 000 r/min在離心機中離心5 min，取出后測量乳化層的體積（mL）。計算樣品的乳化活性（EAI）和乳化穩定性（ESI）。

1.2.3.4 吸油性的測定

稱取0.5 g木瓜蛋白酶酶解物、堿性蛋白酶酶解物、清蛋白，分別和10 mL大豆油于離心管中混勻，室溫靜置30 min，然后以8 000 r/min離心30 min，測定上清液體積，體積減少量即為樣品吸油量。吸油性表示為每克樣品的吸附油體積，平行3組試驗。

將樣品蛋白濃度配制為40 μg/mL，用于ABTS自由基清除能力測定。將配好的ABTS自由基儲備液，用PBS稀釋到A734=0.7±0.2，作為ABTS自由基工作液。在96孔酶標板的每孔中加入100 μL各樣品溶液，再加入100 μL的ABTS自由基工作液，用PBS代替樣品作為對照A0，每個樣品設6個重復，搖勻后黑暗中靜置50 min在734 nm波長下測定吸光度。

1.2.3.6 DPPH自由基清除率的測定

將紫花蕓豆清蛋白、兩種酶解物以及膜分離各組分的蛋白濃度配制為1 mg/mL，采用微量法測定DPPH自由基清除率。取100 μL上述樣品于96孔板中，再加入100 μL濃度為0.04 g/L的DPPH自由基無水乙醇溶液，混合均勻，避光反應50 min后，在517 nm處測其吸光度為Ai；另取100 μL待測樣品，加100 μL無水乙醇，測定吸光度Aj；以100 μL 0.04 g/L的DPPH自由基無水乙醇溶液和100 μL無水乙醇反應作為參比，其吸光度為A0。所有的測量都需要平行6次。DPPH自由基清除率計算公式為：

2 結果與分析

2.1 四種蛋白酶對紫花蕓豆清蛋白水解度的影響

由圖1可知，采用四種蛋白酶水解紫花蕓豆清蛋白，堿性蛋白酶的水解度最大，其次是木瓜蛋白酶，而復合蛋白酶和中性蛋白酶的水解較差，都低于5%。圖2為四種蛋白酶水解2 h后的蛋白電泳圖譜。由圖2可以看出，水解前的紫花蕓豆清蛋白分子量主要集中在45 kDa，此外在25和70 kDa左右還有三條明顯的條帶。復合蛋白酶和中性蛋白水解后，70 kDa的兩條亞基降解了，但其他亞基沒有變化；而木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解后，水解液中基本上觀察不到18 kDa以上的蛋白條帶，表明水解效果較好。

圖1 四種蛋白酶對紫花蕓豆清蛋白水解度的影響

圖2 酶解前后蛋白質變化情況

2.2 酶解對紫花蕓豆清蛋白功能性質的影響

2.2.1 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的紫外光譜掃描

蛋白質產生紫外吸收光譜主要由于色氨酸和酪氨酸殘基側鏈基團對紫外光的吸收，其次是苯丙氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基側鏈基團對紫外光的吸收。由圖3可知，兩種酶解均可提高紫花蕓豆清蛋白的紫外吸收，兩個吸收峰分別位于235和280 nm附近。經過酶解作用的紫花蕓豆清蛋白，肽鏈長度發生變化，蛋白質空間結構也發生改變，內部的生色基團暴露出來，導致紫外吸收增強。

圖3 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的紫外光譜掃描

2.2.2 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的起泡性與泡沫穩定性

由圖4和圖5可知，酶解提高了紫花蕓豆清蛋白的起泡性和起泡穩定性；其中木瓜蛋白酶效果優于堿性蛋白酶。蛋白分子中含有親水基團和疏水基團，能降低水的表面張力，在劇烈攪拌時可形成泡沫。蛋白質的起泡活性和溶解度是呈正相關的，這是由于溶解度提高有助于蛋白擴散在油/水和氣/水界面，起泡性也得到了改進。酶解提高了蕓豆清蛋白的溶解性，其起泡性也隨之增加。

圖4 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的起泡性

圖5 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的泡沫穩定性

2.2.3 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的乳化性與乳化穩定性

由圖6可知，酶解前后紫花蕓豆清蛋白的乳化性和乳化穩定性沒有顯著性改變。蛋白質的溶解度、疏水性、擴散到界面的速率、分子間相互作用、表面電荷和水合度等因素皆可影響乳化性。酶解可改變蛋白質的空間構象，使原先埋藏于分子內部的疏水區域暴露于溶液，表面疏水性和表面電荷增加，提高了蛋白的乳化性，但是隨著肽鍵的水解，使蛋白質分子量進一步減低，逐漸失去表面活性作用，又可降低蛋白的乳化性。所以雖然酶解前后紫花蕓豆清蛋白的乳化性沒有改變，但其實是多因素綜合作用的結果。

圖6 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的乳化性與乳化穩定性

2.2.4 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的吸油性

由圖7可以看出，酶解前后蕓豆清蛋白的吸油性存在顯著性差異，酶解降低了紫花蕓豆清蛋白的吸油性。蛋白質肽鍵水解，分子量降低，疏水性較弱，與油結合機會減少。所以其吸油性產生了下降的現象。

圖7 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的吸油性

2.2.5 酶解對蕓豆清蛋白抗氧化活性的影響

由圖8可知，酶解前蕓豆清蛋白的抗氧化活性較弱，酶解可使其抗氧化活性顯著升高。與未酶解的蕓豆蛋白相比，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解物的ABTS和DPPH自由基清除能力顯著升高，其中木瓜蛋白酶解產物的ABTS和DPPH自由基清除率都優于堿性蛋白酶，尤其木瓜蛋白酶水解產物ABTS自由基清除率，由原來酶解前的17%提高到73%，所以木瓜蛋白酶更適合制備蕓豆抗氧化活性肽。

圖8 酶解前后紫花蕓豆清蛋白的抗氧化活性

3 結論

4種商業蛋白酶中堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解效果較好；酶解后紫花蕓豆清蛋白的抗氧化活性、起泡性及起泡穩定性明顯提高；紫外吸收增強；但吸油性明顯降低，乳化性及其穩定性沒有變化；酶解后的紫花蕓豆清蛋白更有利于其在食品加工及功能性食品研發方面的應用。