柚皮苷酶脫苦工藝優化及對金桔汁品質的影響

盛金鳳，何雪梅，孫健*，零東寧，李麗，李昌寶

1. 廣西農業科學院農產品加工研究所（南寧 530007）；2. 廣西果蔬貯藏與加工新技術重點實驗室（南寧 530007）

金桔（Kumquat），也稱金柑，因具有甜、酸、苦、辣、麻五味，故又名五味果，是一種營養成分豐富的水果。果皮中富含揮發性精油和類胡蘿卜素，果實中含有豐富的蛋白質、維生素、胡蘿卜素、糖、酸、鈣、鎂、鐵、磷等成分[1]。現代醫學證明，金桔還具有較高的藥理活性，對胃病、氣管炎、膽囊炎、肝炎、高血壓、血管硬化等癥狀有一定的輔助治療作用[2-3]，是一種極富開發前景的水果。但是在前期的研究中發現，金桔具有柑橘屬果實共有的苦味物質，成熟的柑橘類果實鮮食沒有苦味，但經放置或加工（如榨汁、發酵、殺菌等）后會出現強烈的苦味，即柑橘的“后苦味”現象，已成為嚴重影響產品品質、制約柑橘類果實開發利用的瓶頸問題[4-5]。因此，開展金桔汁脫苦技術研究，解決金桔汁的制約性苦味問題，對提升金桔汁的品質、促進金桔的開發利用具有重大意義。

柑橘類苦味物質主要分為兩大類：一類是三萜類化合物，代表物為檸檬苦素、諾米林等；另一類是黃酮類化合物，主要代表物為柚皮苷、新橙皮苷等，以柚皮苷為主[6-9]。果實種子是合成檸檬苦素類似物最多的部位，只要去除種子，檸檬苦素類似物對金桔苦味影響不大。柚皮苷類主要在果皮中，金桔果實一般帶皮榨汁，是金桔中“后苦味”形成的主要物質[10-12]。脫除類金桔苦味物質的方法主要有物理法和生物法。物理脫苦法主要包括吸附脫苦、屏蔽法脫苦、膜分離脫苦、超臨界CO2脫苦和添加苦味抑制劑脫苦等。生物脫苦法主要包括代謝脫苦、酶法脫苦、固定化細胞脫苦和基因工程脫苦等[5,13-14]。酶法脫苦具有專一性強、對果汁風味和營養成分破壞小、效果好、操作簡單、成本低等特點，是目前較為理想的脫苦方法[5,15]。王鴻飛等[14]開展了柚皮苷酶對胡柚汁脫苦效果的研究，在單因素試驗的基礎上通過正交試驗優化了柚皮苷酶的最佳脫苦工藝條件，脫苦率達85%。曾霖霖[5]利用柚皮苷酶對金桔汁進行脫苦，采用響應面法優化了脫苦的最佳工藝，脫苦率為48.23%。可見利用柚皮苷酶對金桔汁脫苦的研究較少，且脫苦率（48.23%）未達到理想值，因此需要進一步優化工藝，提高脫苦率。柚皮苷酶的生物活性受到很多條件的限制，要保持酶的最大活性通常需要注意酶用量、反應pH、反應溫度和作用時間等因素。在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法就柚皮苷酶對金桔汁脫苦的工藝進行優化，提高金桔汁的脫苦率，同時考察脫苦對金桔汁營養成分的影響，為金桔汁的酶法脫苦技術提供技術依據，為金桔的產業化開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金桔，新鮮果實，產于廣西陽朔；柚皮苷，Sigma公司；柚皮苷酶，河南領航。

L 400低速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；RE-52 AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；752 N紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；101-3電熱鼓風恒溫干燥箱（上海浦東形容科學儀器有限公司）；SHZ-82水浴恒溫振蕩器（金壇市恒豐儀器廠）；CU 600型電熱恒溫水箱（上海福瑪實驗有限公司）；UW 4200 S電子天平（日本島津）；PHS-25 pH計，手持式折光儀。

1.2 金桔汁制備、脫苦工藝流程

原料清洗→榨汁→粗濾→離心過濾（8 000 r/min，10 min）→酶解脫苦→滅酶（95 ℃，5 min）→測定柚皮苷含量和VC含量→計算脫苦率和VC保留率

1.3 柚皮苷的測定和脫苦率的計算

采用改進的Davis法。

1.3.1 樣品測定

精確吸取0.5 mL金桔汁于25 mL具塞試管中，分別加入5.0 mL 90%的二甘醇溶液、0.5 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，搖勻后于40 ℃保溫10 min，在432 nm出測吸光度。以0.5 mL樣液，加入5.0 mL 90%的二甘醇溶液、0.5 mL蒸餾水作為試劑空白。所得吸光度根據柚皮苷標準曲線計算樣液中柚皮苷含量。

1.3.2 脫苦率計算

脫苦效果評價以金桔汁中柚皮苷脫除率來表示，脫除率的計算采用式（1）。柚皮苷含量越低，柚皮苷脫除率越高，脫苦效果越好。

式中：D為柚皮苷脫除率，即脫苦率，%；A0為處理前金桔汁中柚皮苷含量，mg/mL；A1為脫苦處理后金桔汁中柚皮苷含量，mg/mL。

1.4 柚皮苷酶脫苦單因素試驗

以柚皮苷酶脫苦率和VC保留率為考察指標，選取柚皮苷酶的用量（0.2～1.0 g/L）、金桔汁pH（2～6）、酶解溫度（30～70 ℃）和酶解時間（30～150 min）四個影響因素進行研究。

1.5 響應面分析試驗

根據Box-Behnken試驗設計原理，綜合前期單因素試驗結果，選取柚皮苷酶的用量、金桔汁pH、酶解溫度、酶解時間進行四因素三水平響應面分析試驗，對柚皮苷酶脫苦工藝進行優化。每個自變量的低、中、高水平分別以-1，0和1編碼，以金桔汁脫苦率Y為響應值，其具體因素與水平列表見表1。

表1 響應面試驗因素與水平

1.6 柚皮苷酶脫苦處理后金桔汁品質的測定

1.6.1 維生素C保留率

VC含量的測定采用GB/T 5009.159—2003《食品中還原型抗壞血酸的測定》中的分光光度法采用測定。VC保留率的計算采用式（2）。

式中：R為VC保留率，%；C0為處理前金桔汁中VC含量，mg/mL；C1為脫苦處理后金桔汁中VC含量，mg/mL。

1.6.2 可溶性固形物（TSS）含量

采用GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中的折光計法進行測定。

1.6.3 可滴定酸（TAA）含量

總酸含量測定采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的pH電位法進行測定。

1.6.4 游離氨基酸含量

采用氨基酸全自動分析儀進行測定。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 柚皮苷酶用量對脫苦效果的影響

從圖1中可以看出，隨著酶用量的增加，脫苦率呈逐漸增大的趨勢。當酶用量為0.2～0.6 g/L時，脫苦率迅速增大，從54.6%增大至79.2%；當酶用量大于0.6 g/L時，脫苦率呈現緩慢增大的趨勢。柚皮苷酶用量對脫苦效果有較大的影響。用量少，苦味物質柚皮苷水解不完全，不能達到脫苦的目的；用量過多，雖能使得柚皮苷盡可能水解，果汁苦味減輕，但酶蛋白過多會引起的混濁、沉淀等現象，給后續工藝增加許多麻煩。因此選擇柚皮苷用量為0.5～0.7 g/L。

圖1 柚皮苷酶用量對脫苦率的影響

2.1.2 pH對脫苦效果的影響

如圖2所示，柚皮苷酶對金桔汁的脫苦率隨pH的增大呈現先增高后降低的趨勢，當pH為4.0時，脫苦率達到最高。故選擇果汁pH在3～5范圍內進行下一步優化試驗。pH脫苦效果的影響不僅在于柚皮苷酶對柚皮苷的水解作用，而且還影響到果汁本身中所含柚皮苷的穩定性。一方面，酶對底物進行作用時有其最適pH范圍，不在最適pH范圍內酶本身的活性將受到影響，發揮不了對底物應有的作用，對苦味物質的水解作用降低從而影響脫苦率；另一方面，果汁中的柚皮苷對果汁的pH具有不穩定性，也會影響到用柚皮苷酶進行脫苦時的效果。

2.1.3 酶解溫度對脫苦效果的影響

酶解溫度在30～50 ℃之間時，柚皮苷酶對金桔汁的脫苦率迅速增大；在50 ℃到達最高點；當溫度高于50 ℃時，脫苦率開始減小；高于60 ℃時，脫苦率快速下降（圖3）。說明柚皮苷酶對金桔汁中柚皮苷的酶解最適溫度區間為50 ℃左右。柚皮苷酶有最適反應溫度，溫度過低，激發不了酶的活力，使酶發揮不了應有的作用，會降低對果汁的脫苦效果；溫度過高，能使酶蛋白變性而失去活力。

圖2 pH對脫苦率的影響

圖3 酶解溫度對脫苦率的影響

2.1.4 酶解時間對脫苦效果的影響

如圖4所示，脫苦率隨著酶解時間的延長先增大后減小，在90 min時達到最大值，脫苦率達到77.3%，苦味明顯減輕。酶解時間在30～90 min時，底物濃度高，在酶用量一定時酶解速率高，脫苦率迅速增大。當柚皮苷逐漸被轉化之后，底物減少，酶解速率下降，同時酶隨著時間的延長而部分變性。因此選擇酶解時間為80～120 min。

圖4 酶解時間對脫苦率的影響

2.2 響應面法優化金桔汁脫苦工藝

2.2.1 回歸方程的建立

采用響應面分析軟件Design Expert 7.0.0（Stat-Ease，Inc.，Minnesota，USA）設計試驗方案，具體見表2。

對表2中試驗數據進行分析，結果見表3，經回歸擬和后，各試驗因子對響應值的影響可通過回歸方程來表示：

Y=81.86-1.40A+2.00B+1.05C-2.23D+0.35AB+0.20AC+0.28AD-0.19BC+0.098BD+0.74CD-3.18A2-5.36B2-4.20C2-3.09D2（R2=0.948 8）

表2 響應面分析試驗方案及結果

由表3可知，方程達極顯著水平，同時失擬項不顯著，說明方程對試驗的擬合度較好，可用方程為不同脫苦條件下柚皮苷酶對金桔汁的脫苦率進行預測。根據F值可以看出，酶解時間、酶解溫度、酶添加量和酶解pH及各因素的二次項對柚皮苷酶脫苦率的影響均達到極顯著水平（p＜0.01），而各因素交互作用的影響均不顯著（p＞0.05）。依據系數估計值可知，各因素的主效應關系為：酶解時間＞pH＞酶添加量＞酶解溫度。在α=0.05顯著水平下剔除不顯著項后，對回歸方程（3）進行簡化，得：

Y=81.86-1.40A+2.00B+1.05C-2.23D-3.18A2-5.36B2-4.20C2-3.09D2

表3 柚皮苷酶脫苦率的回歸分析結果

2.2.2 因素間交互作用分析

由表3中回歸分析結果可知，各因素對脫苦率的影響均達到顯著性水平（p＜0.01），但各因素間交互作用的影響均未達到顯著水平（p＞0.05），說明各因素的主效應是相互獨立的。圖1為各因素的三維響應面圖形，由各圖形中的等高線形狀來看，等高線均為圓形且較稀疏，說明交互作用不明顯。由圖1（A）中酶添加量和pH的響應面圖形可知，pH對脫苦率影響較大，在較低的pH環境下，脫苦率較小，隨著pH的增大，脫苦率也逐漸增大，在pH 4.2左右時達到最大。因此在酶解過程中嚴格控制溶液的pH十分重要。圖1（B）顯示了酶添加量與酶解溫度的交互作用，兩者對脫苦率的影響均呈現先增大后減小的趨勢，當酶添加量為0.62 g/L，酶解溫度為55 ℃時脫苦率達到最大。圖1（C）為酶添加量與酶解時間交互作用圖，兩因素對脫苦率的影響并不明顯。圖1（D）顯示，當pH與酶解溫度較低時，脫苦率非常低，隨著兩因素水平的提高，當酶解溫度在50 ℃左右，pH為4左右時，脫苦率達到最大，隨后呈下降趨勢。從圖1（E）中可知，酶解時間對脫苦率的影響較小，而pH對脫苦率的影響大，當pH為4.2，酶解時間為90 min時，脫苦率達到最大值。圖1（F）表示酶解溫度與酶解時間對脫苦率的影響，兩因素的響應面圖形與圖E相似，適當的酶解溫度對脫苦率影響較大，而酶解時間對脫苦率影響較小。

2.2.3 最佳提取工藝的確定

根據設計模型分析得知，柚皮苷酶脫苦的最優工藝參數為：酶添加量0.58 g/L，pH 4.17，酶解溫度50.84 ℃，酶解時間92.86 min。在此條件下脫苦率為82.63%。為驗證該模型的可靠性，根據實際操作，將工藝參數修正為：酶添加量0.6 g/L，pH 4.2，酶解溫度51 ℃，酶解時間93 min。在此條件下，實際脫苦率為81.74%，為模型預測值的98.9%，說明采用響應面分析法優化得到的柚皮苷酶脫苦工藝參數準確可靠。

圖5 各因素交互作用對柚皮苷酶脫苦率的影響

2.3 脫苦處理后營養品質的變化

表4 脫苦處理后金桔汁營養成分的變化

經柚皮苷酶脫苦處理3，7和30 d后，金桔汁各營養指標的變化見表4。經柚皮苷酶法脫苦后，VC含量有一定下降，與對照相比，脫苦處理3 d后，VC含量下降21.2%，7 d后下降22.4%，30 d后下降25.9%，說明酶法脫苦對VC影響較大，處理3 d內迅速下降，3 d后基本穩定。比較脫苦前后可溶性固形物、總酸和總氨基酸含量的變化，發現柚皮苷酶對這三個指標影響不大，30 d后分別下降5%，3%和10.2%。總體來說，柚皮苷酶脫苦法對金桔果汁的營養品質影響較小，是一種適宜的脫苦方法。

3 討論

苦味是影響金桔產品品質的重要因素之一，加工產品中苦味物質含量過多會影響它的風味。因此開展金桔脫苦研究，對提升金桔加工產品品質有重要意義。脫除柑橘苦味物質最常用的方法是吸附法和屏蔽法[16-17]。吸附法采用吸附劑，有選擇地吸附除去柑橘類果汁中的苦味成分，從而達到脫苦的目的。吸附法的優點是脫苦效率高，達90%以上，處理過程帶入到果汁中的雜質少，但處理后的果汁由于pH的上升，會引起了一些化學反應，使產品產生硫化物的氣味，并且對維生素C的吸附量也高達50%以上，對β-胡蘿卜素的影響較大[14,18]。脫苦后的果汁風味與營養品質降低。屏蔽法脫苦一般添加β-環狀糊精（β-CD）。β-CD的主要特征是疏水空洞內可嵌人一些分子大小、形狀及性質相互匹配的化合物，與苦味物質形成穩定的絡合物（包結復合物），可有效增加苦味閾值，降低對苦味的敏感性。該方法簡單方便，不需額外的設備。檸檬苦素脫除率為86.53%，柚皮苷脫除率為24.17%，VC損失率為4.68%，脫苦效果良好，但β-CD的添加會影響果汁口感[16]。

4 結論

試驗采用柚皮苷酶法脫苦技術對金桔汁進行脫苦處理，經脫苦條件優化，在酶添加量0.6 g/L，pH 4.2，酶解溫度51 ℃，酶解時間93 min的條件下，脫苦率達到81.74%。經柚皮苷酶脫苦處理30 d后的金桔汁，VC含量下降25.9%，其他營養指標如可溶性固形物、總酸和總氨基酸含量的變化不大。總體來說，柚皮苷酶脫苦法對金桔果汁是一種適宜的脫苦方法。

柚皮苷酶由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成。α-L-鼠李糖苷酶可將柚皮苷水解為櫻桃苷和鼠李糖，櫻桃苷的苦味約為柚皮苷的1/3；櫻桃苷可在β-D-葡萄糖苷酶的繼續作用下生成無苦味的柚皮素和葡萄糖[19]。酶法脫苦具有專一性強、對柑橘果汁風味和營養成分無破壞、效果好、成本低等特點[14]，具有其它方法所沒有的高效、快速及高選擇性等優點，是目前較為理想的脫苦方法，該方法為金桔產品的脫苦處理提供技術支撐，對提升金桔加工產品品質有重要意義。