雙酶糖化協同蜂蜜接合酵母發酵黃酒的工藝

張敏倩，劉功良*，余潔瑜，白衛東，賈愛娟，何松貴

1. 仲愷農業工程學院輕工食品學院（廣州 510631）；2. 廣東美味鮮調味食品有限公司（中山 528437）；3. 廣東省九江酒廠有限公司（佛山 528203）

黑糯米中蛋白質、維生素和礦物元素等含量高于普通白糯米[1-2]，是一種具有延緩衰老、增強免疫力、保護心血管、改善睡眠等保健功效的健康食品[3-5]。目前，黑糯米的加工方向主要有黑糯米酒、保健飲品、食品增稠劑、黑米產品等。其中，黑糯米酒因其極高的營養價值及保健作用而深受消費者歡迎[1]。

客家黃酒的傳統釀造工藝具有工藝復雜[6]、周期長導致的生產效率低下、勞動強度高等特點。為了縮短發酵周期、減少發酵階段的雜菌生長[7-8]、降低成品酒批次間的不穩定因素，試驗以黑糯米為原料，采用雙酶糖化的方法代替傳統釀酒階段中的拌曲階段，添加α-淀粉酶進行液化后加入糖化酶糖化得到還原糖，并在適當環境條件下添加蜂蜜接合酵母進行酒精發酵。通過單因素和正交試驗設計得出黑糯米酒的最佳釀造工藝條件，旨在保證黑糯米酒品質的前提下減少傳統生產工藝的繁瑣性與不穩定性，更好地控制甜酒的風味和營養成分，改善操作環境[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑糯米（市售）；α-淀粉酶（山東隆科特酶制劑有限公司）；糖化酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；蜂蜜接合酵母（實驗室自行篩選的菌株）；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、濃鹽酸、甲醛、鄰苯二甲酸氫鉀（天津大茂化學試劑廠）；次甲基藍、酚酞指示劑（西隴化工股份有限公司）；氫氧化鈉（天津市福晨化學試劑廠）；甲基紅（廣州化學試劑廠）；所有試劑均為分析純。

HWS 12電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；SW-CJ-2 FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；HZQ-C恒溫培養搖床（哈爾濱市東明醫療儀器廠）；DHP-9602電熱恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；LX-B 50 L高壓滅菌鍋（合肥華泰醫療設備有限公司）；JJ 600電子分析天平（廣州市正一科技有限公司）；WA.91-HJ 7電子萬用爐（北京卓川科技有限公司）；WA.91-HJ 7加熱套電爐（北京卓川科技有限公司）；0-40酒精比重計（余姚市方橋實驗儀表廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑糯米酒的釀制流程

1.2.2 單因素試驗方法

1.2.2.1 液化時間對總糖的影響

稱取200 g煮熟的黑糯米，添加α-淀粉酶20 U/g（酶活力單位40 000 U/mL），即添加α-淀粉酶0.1 mL，于75 ℃水浴條件下液化，每20 min取樣1次測定總糖含量（3 h后可每隔40 min取樣測1次）。

1.2.2.2 液化溫度對總糖的影響

將5個裝有100 g黑糯米的錐形瓶分別水浴加熱保溫至70，75，80，85和90 ℃，加入α-淀粉酶20 U/g進行液化。在方法1.2.2.1的最佳液化時間基礎上液化至結束，取樣測定總糖含量。

1.2.2.3 糖化時間對總糖的影響

將5個裝有100 g黑糯米的錐形瓶，在方法1.2.2.2液化最佳條件的基礎上液化至結束并冷卻，水浴保溫至60 ℃，再添加糖化酶140 U/g（酶活力100 000 U/mL）即添加糖化酶0.15 mL，糖化30 h，每隔5 h取樣測定總糖含量。

1.2.2.4 糖化溫度對總糖的影響

將5個裝有100 g黑糯米的錐形瓶，在方法1.2.2.1和1.2.2.2液化最佳條件的基礎上液化至結束并冷卻，分別水浴保溫至50，55，60，65和70 ℃，在步驟1.2.2.3最佳糖化時間的基礎上加入糖化酶140 U/g水浴保溫至糖化結束，取樣測定總糖含量。

1.2.2.5 α-淀粉酶添加量對黑糯米酒發酵的影響

在方法1.2.2.1～1.2.2.4基礎上，分別選取α-淀粉酶添加量8，16，24，32和40 U/g進行液化、糖化酶140 U/g糖化至結束，接種量體積分數20%的蜂蜜接合酵母，放置恒溫培養箱于28 ℃條件下恒溫培養10 d。前發酵結束后測其總糖含量、總酸含量以及酒精度。

1.2.2.6 糖化酶添加量對黑糯米酒發酵的影響

在方法1.2.2.1～1.2.2.5基礎上，加入適量的α-淀粉酶液化，液化結束后分別添加糖化酶110，130，150，170和190 U/g糖化至結束，接種量體積分數20%的蜂蜜接合酵母，放置恒溫培養箱于28 ℃條件下恒溫培養10 d，前發酵結束后測其總糖含量、總酸含量、酒精度。

1.2.2.7 蜂蜜接合酵母接種量體積分數對黑糯米酒發酵的影響

在方法1.2.2.1～1.2.2.6基礎上液化糖化后，分別接種量體積分數5%，10%，15%，20%和25%的蜂蜜接合酵母，放置恒溫培養箱于28 ℃條件下恒溫培養10 d，前發酵結束后測其總糖含量、總酸含量及酒精度。

1.2.3 各項指標檢測方法

總糖測定，采用費林法，參照GB/T 13662—2008《黃酒》執行；總酸測定，采用酸堿滴定法，參照GB/T 13662—2008《黃酒》執行；酒精度測定，采用酒精計法，參照GB/T 13662—2008《黃酒》執行。

2 結果與分析

2.1 液化工藝條件的確定

2.1.1 液化時間對總糖的影響

由圖1可知，液化時間對總糖含量的影響較為顯著。在液化過程中，隨著液化酶解時間增長，糖液中總糖含量呈現上升趨勢，液化酶作用在200 min內能達到理想的效果；液化時間大于200 min后，糖液總糖度上升趨勢開始變緩，這是由于底物大部分被酶解，故酶解時間的增長也不會使總糖含量明顯上升。為了節約時間資源，提高酶解效率，取最佳液化時間為200 min。

圖1 液化時間對總糖的影響

2.1.2 液化溫度對總糖的影響

由圖2可知，液化溫度70～80 ℃時，隨溫度升高，糖液中總糖含量增加；液化溫度80～90 ℃時，隨溫度升高，糖液中總糖含量降低。這是由于α-淀粉酶的活性受溫度影響較大，低于最適溫度時，酶解效率隨溫度升高而增大；高于最適溫度時，隨著溫度升高，酶開始變性失活導致酶促反應速率降低，從而淀粉被酶解的量減少，故糖液總糖含量降低。因此，最佳液化溫度為80 ℃，總糖含量可達54 g/L。

圖2 液化溫度對總糖的影響

2.2 糖化工藝條件的確定

2.2.1 糖化時間對總糖的影響

由圖3可以看出糖化時間對總糖含量影響顯著。在糖化過程中，隨著糖化酶酶解時間增加，糖液中的總糖含量在25 h內呈現上升趨勢，25 h后趨于平緩。25 h后糖化時間增加對總糖含量的影響不顯著。因此，最佳糖化時間為25 h。

圖3 糖化時間對總糖的影響

2.2.2 糖化溫度對總糖的影響

由圖4可知，糖化溫度50～60 ℃時，隨溫度升高，糖液中的總糖含量增加；糖化溫度60～70 ℃，隨溫度升高，糖液中總糖含量降低。這是由于糖化酶的活性受溫度影響較大。低于最適溫度時，酶解效率隨溫度升高而增大；高于最適溫度時，隨著溫度升高酶變性失活使酶促反應速率大大降低，從而減少淀粉被酶解的量致使糖液總糖含量降低。因此，最佳糖化溫度為60 ℃，總糖含量可達163.4 g/L。

圖4 糖化溫度對總糖的影響

2.3 α-淀粉酶添加量對黑糯米酒發酵的影響

由表1可知，α-淀粉酶添加量8～32 U/g時，總糖、總酸的含量及酒精度隨著α-淀粉酶添加量的增加而升高；α-淀粉酶添加量超過32 U/g時，總糖、總酸的含量及酒精度均變化不大。分析其原因可能是：1）隨著α-淀粉酶添加量增大，淀粉被酶解成酵母可利用的還原糖則越多，總糖含量越高，發酵產酸則越多，這可能是因為產酸菌利用酵母菌糖化得到的大量還原糖進行自身繁殖并代謝產酸，使得酒體中總酸含量上升，但α-淀粉酶添加量超過32 U/g時，沒有更多的作用底物，所以總糖含量基本不變，總酸含量也幾乎維持不變；2）隨著α-淀粉酶添加量增大，淀粉被酶解成酵母可利用的還原糖則越多，在無氧條件下，酵母利用還原糖發酵生成酒精，致使酒精度提高，但α-淀粉酶添加量超過32 U/g時，沒有更多的作用底物，所以總糖含量基本不變，酒精度也幾乎維持不變。

表1 α-淀粉酶添加量對黑糯米酒發酵的影響

因此，α-淀粉酶添加量過少，低糖濃度的糖液不利于酵母發酵產生酒精；α-淀粉酶添加量過多則造成資源浪費（酶成本高）。因此，選擇32 U/g為最適的α-淀粉酶添加量。

2.4 糖化酶添加量對黑糯米酒發酵的影響

由表2可知，隨著糖化酶添加量增大，黑糯米酒的3項指標均是先增大后趨于平緩；糖化酶添加量170 U/g時，總糖含量及酒精度達到最高值；糖化酶添加量大于170 U/g，總酸含量有小幅減少，這可能是因為酒體中總酸含量達到一定量后，不耐酸微生物大量衰亡，微生物代謝活動均比較緩慢，致使各層酸的生成幅度不大而造成總酸含量小幅減少[11]。

為防止資源浪費，得到較高酒精度黑糯米酒，最適糖化酶添加量選擇170 U/g為宜。

表2 糖化酶添加量對黑糯米酒發酵的影響

2.5 蜂蜜接合酵母接種量體積分數對黑糯米酒發酵的影響

從表3可知，總糖含量隨著酵母接種量體積分數的增大而減小。這是由于在同一時間內，相對較多的酵母菌利用糖液中的糖類物質轉化為酒精，導致糖液糖度降低。此外，酵母接種量體積分數過大時，發酵液中大多數糖被酵母用于自身的生長繁殖，且在不補糖的情況下酵母菌無法正常進行各項生命活動導致其逐漸衰老死亡使得發酵液的總糖含量大幅減少[12]。

總酸含量隨著酵母接種量體積分數增加而增大。從表3可知，在糯米酒的發酵過程中總酸含量并增大幅度不大且酸度適宜[13]。

接種量體積分數5%～20%時，隨著酵母接種量體積分數加大，酒精度逐漸增大；接種量體積分數20%～25%時，隨著酵母接種量體積分數加大，酒精度逐漸降低。這是由于酵母接種量體積分數較少時，糖液中的糖無法充分被酵母利用，發酵緩慢從而造成酒精度較低；酵母接種量體積分數增大時，在同一時間內相對較多的酵母菌利用糖液中的糖類物質轉化為酒精致使酒精度升高；酵母接種量體積分數繼續增大，還原糖被酵母的生長繁殖消耗所利用而不能產生酒精，從而酒精度發生下降。因此，酵母接種量體積分數過少，酒液酒精度低，發酵不充分而影響口感；酵母接種量體積分數過多則容易導致酵母菌利用還原糖進行生長繁殖而抑制酒精發酵。因此，蜂蜜接合酵母的最佳接種量體積分數為20%。

表3 蜂蜜接合酵母接種量體積分數對黑糯米酒發酵的影響

2.6 正交試驗設計及驗證

表4 黑糯米酒釀造工藝條件正交試驗因素水平

表5 黑糯米酒釀造工藝的正交試驗結果與極差分析

選取α-淀粉酶添加量、糖化酶添加量、蜂蜜接合酵母接種量體積分數作為3個單因素進行正交優化試驗，以酒精度作為檢測指標，研究最佳的黑糯米酒發酵工藝參數。在單因素試驗基礎上，選取適當因素水平，按L9(34)正交表進行正交試驗，并通過極差分析確定黑米酒釀造的最佳工藝參數，正交試驗設計因素及水平見表4，結果與分析見表5。

由表5中的極差值R可以看出，對黑糯米酒酒精度影響的主次順序依次為C＞A＞B，即蜂蜜接合酵母添加量＞α-淀粉酶添加量＞糖化酶添加量。由K值可知，黑糯米酒的理論最佳組合為A2B2C2，但該組合與酒精度最高的組合A1B2B2不一致，因此，為進一步驗證最佳工藝條件，對2組合進行驗證試驗，組合為A2B2C2的酒精度最高，達12.3%vol，確定為實際最優方案。因此，黑糯米酒的最佳工藝為條件為：α-淀粉酶添加量32 U/g、糖化酶添加量170 U/g、酵母添加量20%。

3 結論與展望

以黑糯米為原料，利用雙酶糖化協同蜂蜜接合酵母發酵制備黑糯米酒。通過單因素和正交試驗設計，得出黑糯米酒最佳發酵工藝條件為：α-淀粉酶添加量32 U/g，液化溫度80 ℃，液化時間200 min；糖化酶添加量170 U/g，糖化溫度60 ℃，糖化時間25 h；蜂蜜接合酵母接種量體積分數20%，發酵溫度28 ℃。經過10 d前發酵，其總糖為43.5 g/L，總酸為4.8 g/L，酒精度可達12.3%vol。以該工藝釀出的黑糯米酒酒味純正，芳香清甜，口感醇厚，帶有糯米特有的香味；可有效避免發酵期間雜菌的生長，無需經驗豐富的釀酒技工也可得到高品質的黃酒。但該工藝仍有不足，主要為：α-淀粉酶及糖化酶的糖化溫度相較于傳統工藝糖化溫度較高，這將造成無法避免的熱能浪費；α-淀粉酶及糖化酶作用于黑糯米代替拌曲進行糖化，還需考慮酶的作用pH，在不調pH條件下是否對發酵產品酒質產生影響還需進一步探究；該工藝采用的前發酵時長有待改善；黑糯米中含有很多活性物質，具有較強的保健功能，該工藝釀制出的黑糯米酒是否保留了黑糯米原有的活性物質還需做進一步研究。