提取黑果腺肋花楸果中金絲桃苷的工藝

宋健剛，鐘方麗*，王曉林，牟榮琴

吉林化工學院化學與制藥工程學院（吉林 132022）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）系薔薇科腺肋花楸屬灌木，該樹種集藥用、食用、園林和生態價值于一體，市場前景非常廣闊。其果實為黑色球形，味甜酸稍有澀感，食用方法眾多，如果汁、果脯、果干和果醬等[1-3]。果實富含多酚、維生素和黃酮類化合物，具有眾多的保健功能。在歐美等國家，其果實提取物已在食品、藥品等領域廣泛應用[4-5]。黑果腺肋花楸果具有保肝、抗微波輻射及紫外線作用，還有防治糖尿病及心腦血管疾病等生理活性[6-9]。已從黑果腺肋花楸果實中成分分離得到三萜類、黃酮類、酚酸類、甾醇類、糖及糖苷類等成分[10]，黃酮類化合物以花色苷、槲皮素及其衍生物為主。槲皮素衍生物主要以金絲桃苷、異槲皮素為主，金絲桃苷具有抗炎、抗腫瘤、利尿、止咳、降血壓、降低膽固醇、增強免疫力和抗抑郁等眾多功能[11-12]。離子液體是在室溫下呈液體的有機離子體系，具有溶解能力高、性質穩定、揮發性低等獨特的物理化學性質，與傳統有機溶劑相比，離子液體具有綠色環保、不易燃燒等特點，其在天然植物活性成分提取領域已有所應用[13-15]。超聲波能夠使植物組織破碎，加速提取溶劑在植物中的滲透，如果將離子液體與超聲波聯用，將提高目標物質的提取率[16-17]。因此，試驗采用離子液體輔助超聲波技術，通過單因素試驗和正交試驗優化了黑果腺肋花楸果中金絲桃苷的提取工藝條件，為黑果腺肋花楸果的深入開發提供了試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸果購自吉林省黑果花楸農業科技開發有限責任公司，干燥，粉碎，待用。

金絲桃苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司）；1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽、氯化-1-丁基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽、溴化-1-丁基-3-甲基咪唑（純度99%，上海成捷化學有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，天津大茂化學試劑公司）；水為重蒸餾水；其余所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LC-2000型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；W 5-100 SP型恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）；FA 2004 N型電子分析天平（上海精密科學儀有限公司）；JBT/C-YCL型超聲波藥品處理機（濟寧金百特電子有限責任公司）；JYL型粉碎料理機（山東九陽小家電有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸果提取液中金絲桃苷的HPLC含量測定方法

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱為大連依利特ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.25%醋酸水溶液；程序：0～45 min，15%～20% A；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL；檢測波長為360 nm[18]。在此條件下，金絲桃苷的保留時間為16.03 min，理論塔板數為87 242，與相鄰峰的分離度為2.53。HPLC色譜圖見圖1。

1.3.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取2.30 mg干燥至恒質量的金絲桃苷對照品，置于25 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成質量濃度為0.092 mg·mL-1的對照品溶液，置于冰箱中避光保存備用[19]。

1.3.1.3 供試樣品溶液的制備

稱取5 g黑果腺肋花楸果粉末，放入圓底燒瓶中，以一定的料液比加入離子液體乙醇水溶液，超聲提取，過濾，收集提取液，轉移至50 mL容量瓶中并用提取溶劑稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

1.3.1.4 流動相的選擇

試驗主要考察甲醇-0.1%醋酸水溶液、乙腈-0.25%醋酸水溶液、乙腈-0.25%磷酸水溶液等各種流動相對黑果腺肋花楸果提取液中金絲桃苷保留時間和分離度的影響。

圖1 對照品溶液及供試品溶液的HPLC圖譜

1.3.1.5 線性關系考察

吸取金絲桃苷的對照品溶液，配制成質量濃度分別為0.97，1.84，3.68，5.52，7.36，29.0，11.04，14.72和18.40 μg·mL-1的系列對照品溶液，分別進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積。以金絲桃苷峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線[20]，得回歸方程Y=56.205X+11.297，R=0.998 1（n=9）。結果表明金絲桃苷進樣濃度在0.97～18.40 μg·mL-1范圍內與峰面積線性關系良好。

1.3.1.6 重復性試驗

取6份同一批號黑果腺肋花楸果粉末，按1.3.1.3項下方法制備供試品溶液，進樣量各20 μL，測定金絲桃苷的峰面積。金絲桃苷峰面積分別為140.68，141.87，140.84，141.54，141.95和140.76，RSD為0.41%，表明該含量測定方法具有較好的重復性。

1.3.1.7 儀器精密度試驗

吸取對照品及供試品溶液，連續進樣6次，每次進樣20 μL，分別測定對照品及供試品溶液中金絲桃苷的峰面積。供試品中金絲桃苷峰面積分別為141.84，142.28，139.87，145.62，141.95和140.88，RSD為1.37%。對照品中金絲桃苷峰面積分別為496.09，485.94，497.15，488.47，491.28和487.96，RSD為0.93%，表明儀器精密度符合要求。

1.3.1.8 供試品溶液的穩定性試驗

吸取供試品溶液，分別于0，1，3，5，7和24 h進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積。供試品中金絲桃苷峰面積分別為141.84，140.82，138.75，142.73，141.07和142.12，RSD為0.99%，表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定，滿足測定要求。

1.3.1.9 加樣回收率試驗

稱取6份金絲桃苷含量已知的黑果腺肋花楸果粉末，每份中加入0.5 mL質量濃度為92.00 μg·mL-1的金絲桃苷對照品溶液，按1.3.1.3項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，測定金絲桃苷的峰面積。

1.3.1.10 檢測限與定量限試驗

吸取適量對照品溶液，逐步稀釋，直到檢測峰高為基線噪聲的3倍為止，計算金絲桃苷的最低檢測濃度。結果表明，金絲桃苷的最低檢測限為0.029 44 μg·mL-1。吸取適量對照品溶液，逐步稀釋，直到檢測峰高為基線噪聲的10倍為止，計算金絲桃苷的定量限[21]。結果表明，金絲桃苷的定量限為0.055 20 μg·mL-1。

1.3.2 離子液體超聲輔助提取黑果腺肋花楸果中金絲桃苷工藝條件的優化

1.3.2.1 單因素試驗

1) 離子液體類型的選擇。稱取5 g黑果腺肋花楸果粉末，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.05 mol·L-1的不同離子液體的50%乙醇水溶液，離子液體分別為：溴化-1-丁基-3-甲基咪唑、氯化-1-丁基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽。放入超聲機中，料液比為1:20（g/mL），設定水浴溫度50～60 ℃、超聲功率80 W、提取30 min，過濾，濾液轉移到50 mL容量瓶中，50%乙醇水溶液定容，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。按1.3.1.1節色譜條件進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積，計算金絲桃苷的提取率。

式中：C為提取液中金絲桃苷的質量濃度（μg·mL-1）；V為提取液定容的體積（mL）；W為黑果腺肋花楸果粉末的質量（g）。

2) 提取溶劑的選擇。稱取5 g黑果腺肋花楸果粉末，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.05 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽乙醇水溶液，乙醇體積分數分別設定為0，10%，30%，50%，70%和90%，放入超聲機中，其他按1.3.2.1節中（1）方法提取。按1.3.1.1節色譜條件進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積，計算金絲桃苷的提取率。

3) 離子液體濃度的選擇。稱取5 g黑果腺肋花楸果粉末，放入圓底燒瓶中，加入濃度分別為0.05，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9和1.1 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽50%乙醇水溶液[22]，放入超聲機中，其他按1.3.2.1節中（1）方法提取。按1.3.1.1節色譜條件進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積，計算金絲桃苷的提取率。

4) 料液比的選擇。稱取5 g黑果腺肋花楸果粉末，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.05 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽50%乙醇水溶液，放入超聲機中，料液比分別設定為1:5，1:10，1:20，1:30，1:40和1:50（g/mL），其他按1.3.2.1節中（1）方法提取。按1.3.1.1節色譜條件進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積，計算金絲桃苷的提取率。

5) 提取時間的選擇。稱取5 g黑果腺肋花楸果粉末，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.05 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽50%乙醇水溶液，放入超聲機中，料液比設定為1:20（g/mL），提取時間分別設定為5，10，15，20，30，40，50和60 min，其他按1.3.2.1節中（1）方法提取。按1.3.1.1節色譜條件進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積，計算金絲桃苷的提取率。

6) 超聲功率的選擇。稱取5 g黑果腺肋花楸果粉末，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.05 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽50%乙醇水溶液，放入超聲機中，超聲功率分別為60，70，80，90和100 W，料液比為1:20（g/mL），提取時間為40 min，其他按1.3.2.1節中（1）方法提取。按1.3.1.1節色譜條件進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積，計算金絲桃苷的提取率。

7) 提取水浴溫度的選擇。稱取5 g黑果腺肋花楸果粉末，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.05 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽50%乙醇水溶液，放入超聲機中，料液比設定為1:20（g/mL），超聲功率為90 W，提取時間為40 min，提取水浴溫度分別設定為30～40，40～50，50～60，60～70和70～80 ℃，其他按1.3.2.1節中（1）方法提取。按1.3.1.1節色譜條件進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積，計算金絲桃苷的提取率。

1.3.2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，將提取水浴溫度固定為70～80 ℃，離子液體固定為1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽，離子液體濃度固定為0.05 mol·L-1，選擇提取溶劑乙醇體積分數、料液比、提取時間、超聲功率作為考察因素，按四因素三水平進行試驗，因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.2.3 工藝驗證性試驗

稱取3份黑果腺肋花楸果粉末，每份5 g，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.05 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽60%乙醇水溶液，放入超聲機中，料液比為1:25（g/mL），設定水浴溫度70～80 ℃、超聲功率80 W、提取35 min，過濾，濾液轉移到50 mL容量瓶中，60%乙醇水溶液定容，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。按1.3.1.1節色譜條件，分別進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積，計算金絲桃苷的提取率。

1.3.2.4 離子液體輔助提取黑果腺肋花楸果中金絲桃苷的對比試驗

稱取3份黑果腺肋花楸果粉末，每份5 g，放入圓底燒瓶中，加入60%乙醇水溶液，放入超聲機中，料液比為1:25（g/mL），設定水浴溫度70～80 ℃、超聲功率80 W、提取35 min，過濾，濾液轉移到50 mL容量瓶中，60%乙醇水溶液定容，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。按1.3.1.1節色譜條件，分別進樣20 μL，測定金絲桃苷的峰面積，計算金絲桃苷的提取率。

2 結果與分析

2.1 流動相條件的選擇

結果表明，適宜的流動相為乙腈-0.25%醋酸水溶液梯度洗脫，它能夠將黑果腺肋花楸果提取液中的金絲桃苷與其他物質分開，保留時間適中。按照金絲桃苷峰計理論，塔板數為87 242，與相鄰峰的分離度為2.53，故選擇在上述流動相條件下進行相關試驗。

2.2 加樣回收率試驗

表2顯示，金絲桃苷的平均回收率為98.17%，RSD為1.89%。

表2 回收率試驗結果

2.3 離子液體超聲輔助提取黑果腺肋花楸果中金絲桃苷工藝條件優化試驗結果

2.3.1 單因素試驗結果

2.3.1.1 離子液體類型的選擇

表3顯示，在5種離子液體中，1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽對金絲桃苷的提取效果最好，所以選擇1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽為后續試驗的離子液體。

2.3.1.2 提取溶劑的選擇

由圖2可知，乙醇體積分數在0～50%范圍內，金絲桃苷的提取率隨著乙醇體積分數的升高而增加；當乙醇體積分數達到50%時，金絲桃苷的提取率達到了最高值，繼續提高乙醇體積分數，金絲桃苷的提取率逐漸下降。分析其原因可能是金絲桃苷為黃酮苷，極性較高，當提取溶劑乙醇體積分數較高時，溶劑的極性降低，其對黃酮苷金絲桃苷的溶解能力下降，提取率逐漸降低，所以選擇50%乙醇水溶液為后續試驗的提取溶劑。

表3 離子液體類型的選擇

圖2 乙醇體積分數對提取率的影響

2.3.1.3 離子液體濃度的選擇

由圖3可知，當離子液體濃度為0.05 mol·L-1時，金絲桃苷的提取率達到最高值，之后隨著離子液體濃度的增加，金絲桃苷的提取率逐漸下降。分析其原因可能是隨著離子液體濃度的升高，溶液的黏度增大，溶劑滲透進藥材基質內的能力減小，所以提取時離子液體濃度不要太高。

圖3 離子液體濃度對提取率的影響

2.3.1.4 料液比的選擇

由圖4可知，隨著料液比的增加，金絲桃苷的提取率逐漸升高，當料液比達到1:20（g/mL）時，金絲桃苷的提取率達到最大值。繼續加大料液比，金絲桃苷的提取率緩慢下降。分析原因可能是黑果腺肋花楸果的質量固定時，在一定范圍內提高提取溶劑的用量，會使黑果腺肋花楸果中的金絲桃苷更好地轉移到溶劑中，所以當料液比為1:20（g/mL）時，黑果腺肋花楸果中的金絲桃苷幾乎全部溶出，如果繼續增大料液比，黑果腺肋花楸果中金絲桃苷的溶出變化就不明顯了，所以選擇1:20（g/mL）為后續試驗的料液比。

圖4 料液比對提取率的影響

2.3.1.5 提取時間的選擇

由圖5可知，隨著提取時間的不斷延長，金絲桃苷的提取率不斷提高，當提取時間從5 min增加到40 min時，金絲桃苷的提取率達到到最大值，當提取時間繼續延長時，金絲桃苷的提取率略有下降。分析原因可能是提取時間越長，越有利于金絲桃苷的溶出，但如果提取時間過長會使雜質溶出增加，可能會對其測定有一定的影響，所以選擇40 min為后續試驗的提取時間。

圖5 提取時間對提取率的影響

2.3.1.6 超聲功率的選擇

由圖6可知，隨著超聲功率的不斷增加，金絲桃苷的提取率不斷增加，當超聲功率由60 W提高到90 W時，金絲桃苷的提取率達到最高值，繼續提高超聲功率，金絲桃苷的提取率略有下降。分析其原因可能是隨著超聲功率的提高，超聲波對黑果腺肋花楸果細胞的破碎程度不斷增大，從而加速了金絲桃苷的溶出，但超聲功率過高，可能會對金絲桃苷的結構產生影響或可能會使雜質溶出增加，從而對其測定產生一定的影響，需要進一步研究。

2.3.1.7 提取水浴溫度的選擇

由圖7可知，隨著水浴溫度的提高，金絲桃苷的提取率逐漸提高，當水浴溫度達到70～80 ℃時，金絲桃苷的提取率達到最高值。分析原因可能是隨著水浴溫度的不斷升高，提取溶劑的運動速度不斷增大，當水浴溫度提高到70～80 ℃時，提取溶劑處于微沸狀態，此時溶劑滲透到黑果腺肋花楸果組織細胞中的能力最強，提取率最高。

圖6 超聲功率對提取率的影響

圖7 提取溫度對提取率的影響

2.3.2 正交試驗結果

稱取9份黑果腺肋花楸果粉，每份5 g，放入圓底燒瓶中，按正交試驗表進行試驗，將每組試驗的提取水浴溫度固定為70～80 ℃，離子液體濃度固定為0.05 mol·L-1，結果見表4。

表4 正交試驗設計及試驗結果

結果表明：離子液體超聲輔助提取黑果腺肋花楸果中金絲桃苷的最優方案為A3B3C1D2，各因素的影響大小為乙醇體積分數＞超聲功率＞料液比＞提取時間，即離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽，離子液體濃度為0.05 mol·L-1，料液比為1:25（g/mL），提取溶劑為60%乙醇水溶液，提取時間為35 min，提取溫度為70～80 ℃，超聲功率為80 W。

2.3.3 工藝穩定性驗證試驗

經3次驗證試驗，金絲桃苷的峰面積分別為158.28，165.75和168.95，平均值為164.33，其提取率分別為26.24，27.57和28.30 μg·g-1，平均值為27.37 μg·g-1，RSD為3.80%，結果表明，優選的離子液體超聲輔助提取工藝比較穩定。

2.3.4 對比試驗

提取體系不加入離子液體，其它操作條件與2.3.3節相同，3次試驗結果中，金絲桃苷的峰面積分別為119.55，119.18和112.21，平均值為116.98，其提取率分別為19.32，19.19和17.95 μg·g-1，平均值為18.82 μg·g-1，RSD為3.98%，根據2.3.3節試驗結果可知，離子液體的加入使金絲桃苷提取率提高了45.43%。

3 結論與討論

1) 試驗對黑果腺肋花楸果中金絲桃苷含量的HPLC測定方法進行了考察。結果表明，所建立的含量測定方法操作簡便，精密度高，重復性及線性關系良好，金絲桃苷的平均回收率為98.17%。

2) 試驗采用超聲波輔助離子液體法對黑果腺肋花楸果中的金絲桃苷進行了提取，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗進一步考察了提取工藝參數。結果顯示，最佳提取工藝：離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽，離子液體濃度為0.05 mol·L-1，料液比為1:25（g/mL），提取溶劑為60%乙醇水溶液，提取時間為35 min，提取溫度為70～80 ℃，超聲功率為80 W。在優化提取條件下，金絲桃苷的提取率為27.37 μg·g-1。結果表明，添加有離子液體的乙醇水溶液比純乙醇水溶液對金絲桃苷的提取率提高了45.43%，可能是因為離子液體對植物纖維素的溶解能力較高，有利于目標成分的溶出，從而使提取率提高。該方法具有快速、高效、環保等優點，為黑果腺肋花楸果活性成分的提取提供了一種新方法。