響應面法優化南極磷蝦蛋白酶解工藝條件

張華丹，張玲云，張國玉，梁鵬*

1. 福建農林大學食品科學學院（福州 350002）；2. 遼漁南極磷蝦科技發展有限公司（大連 116113）

南極磷蝦（Antarctic krill）是一類生活在南大洋南極水域的磷蝦，以數億噸之巨的總量成為了南極大多數生物的食物來源[1]。據估計，南極磷蝦的可捕撈量每年超過1 000萬 t。由于世界人口的增加，糧食的短缺，南極磷蝦很可能成為世界上最后的海洋資源[2]。

南極磷蝦是一種高營養價值的水產品，因而具有廣闊的應用前景。南極磷蝦中蛋白含量豐富，必需氨基酸比例合適，是人類理想的高級營養食物[3]，作為一種寶貴的富含ω-3脂肪酸和蛋白質的可持續資源，南極磷蝦可加工成供人類食用的磷蝦粉[4]。目前，南極磷蝦粉是南極磷蝦資源開發利用的主要產品，將南極磷蝦粉及其水解產物作為原料，應用于色素、魚和蔬菜蛋白質、誘食劑等產品中具有很大的市場前景[5]。近年來，國內外研究人員已經對南極磷蝦粉的營養價值及組成成分展開了大量的研究。結果表明南極磷蝦粉中平均蛋白質含量達到60%，且含有豐富的脂肪酸[5]，說明南極磷蝦粉具備較大的開發利用前景。

為進一步開發利用南極磷蝦蛋白粉資源，試驗率先通過酶法水解南極磷蝦粉擬獲得多肽，以期提高其食用營養價值。另外，還可為其水解產物制備成天然魚醬油、食源肽提供優質原料，降低生產成本[6]。然而，目前有關南極磷蝦蛋白粉酶解工藝方面的研究報道還較鮮見。因此，研究擬在比較中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶及堿性蛋白酶酶解效果的基礎上，選擇最優酶對南極磷蝦蛋白粉進行酶解，并采用響應面法來獲得酶解南極磷蝦粉的最優工藝。研究結果可為南極磷蝦粉的深加工提供理論依據，對拓展南極磷蝦蛋白的應用具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦粉：由遼漁南極磷蝦科技發展有限公司饋贈；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶均購自北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉、甲醛等化學試劑（AR），均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫磁力加熱攪拌器（HJ-4 A），江蘇金壇市宏華儀器廠；實驗室pH計（ST 2100），奧豪斯儀器（常州）有限公司；數顯式電熱恒溫水浴鍋（XMTD-204），上海博迅實業有限公司醫療設備廠；臺式高速冷凍離心機（TGL-20 M），湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；自動凱氏定氮儀（K 9840），濟南海能儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解流程

稱取南極磷蝦粉10 g，按以下流程進行酶解[7-8]：

南極磷蝦粉樣品→加入磷酸鹽緩沖溶液→調節至酶的最適溫度和pH→加入蛋白酶→酶解一定時間→95℃滅酶15 min→冷卻至室溫→4 ℃下8 000 r/min離心15 min→過濾→獲得酶解液

1.3.2 水解度（DH）計算

1) 蛋白質水解度是指蛋白質在酶解過程中肽鍵被斷裂的程度，即酶解液中游離氨基酸態氮總含量與總氮含量的比值[9]，計算公式如式（1）所示：

2) 總氮質量分數測定采用國標中凱氏定氮法[10]，計算公式如式（2）所示：

式中：X1為總氮質量分數，g/100 g；V1為試液消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；V3為吸取消化液的體積，mL；m為試樣的質量，g；c為鹽酸標準滴定溶液濃度，mol/L。

3) 酶解液游離氮含量的測定采用甲醛滴定法：參考文獻[9]，并略有改進。取離心過濾后的酶解液10 mL定容于100 mL容量瓶中，吸取10.0 mL稀釋液，置于200 mL燒杯中，加60 mL水，充分混合搖勻，用氫氧化鈉標準溶液[c（NaOH）=0.050 mol/L]滴定至pH計指示pH為8.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數，再加入10.0 mL甲醛溶液，混勻。用氫氧化鈉標準滴定溶液繼續滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數。同時用蒸餾水代替酶解液做空白對照，記下所消耗的標準氫氧化鈉溶液的體積。計算公式如式（3）所示：

式中：X2為試樣中游離氨基酸態氮的含量，g/100 mL；V1為試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V2為試劑空白加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；c為氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度，mol/L；V為吸取試樣的體積，mL；V3為試樣稀釋液的取用量，mL；V4為試樣稀釋液的定容體積，mL。

1.3.3 最優酶及最適料液比選取

將南極磷蝦粉與磷酸鹽緩沖溶液按一定比例配成樣品溶液后，調節至各酶的最適溫度和pH，分別加入酶量為0.4%的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶。酶解結束后，測定其酶解液水解度，比較這四種酶的水解效果，確定最優酶進行后續試驗。

試驗表明，最優酶為堿性蛋白酶。因此在后續研究過程中采用堿性蛋白酶進行試驗。堿性蛋白酶最適pH值為8.0，最適酶解溫度為50 ℃，在最適pH和溫度下，添加0.4%的酶，酶解時間4 h，此條件下，以料液比1:10，1:20，1:30，1:40和1:50（g/mL）進行三次平行試驗。結果表明，當料液比為1:30（g/mL）時酶解液水解度最高，因此以料液比為1:30（g/mL）開展單因素試驗。

1.3.4 單因素試驗

初始pH的選擇：采用不同pH的磷酸鹽緩沖溶液，并用氫氧化鈉溶液調節至酶解初始pH分別為7.5，8，8.5，9和9.5，酶添加量為0.4%，50 ℃下酶解4 h后滅酶離心過濾得酶解液，測定其水解度，確定最佳酶解初始pH。酶解溫度的選擇：在酶解溫度分別為40，45，50，55和60 ℃時，酶添加量為0.4%，在最佳pH條件下酶解4 h測定其酶解液的水解度，以確定最佳的酶解溫度。酶添加量的選擇：測定酶添加量分別為0.4%，0.8%，1.2%，1.6%和2.0%，于最佳酶解pH和溫度時酶解4 h條件下測定其酶解液水解度，確定最佳的酶添加量。酶解時間的選擇：在最佳酶解pH、溫度和酶添加量時，測定酶解時間分別為2，3，4，5和6 h的酶解液水解度，確定最佳酶解時間。

1.3.5 響應面設計

在單因素試驗的基礎上，以水解度為響應值，開展四因素三水平響應面試驗，以確定南極磷蝦蛋白粉酶解的最佳工藝條件。

2 結果與分析

2.1 最優酶及最適料液比的選擇

具有不同構象的蛋白酶，針對同種底物其作用位點不同，產生一定差異的功能特性因而具有不同的反應活力[11]。從圖1中可以看出，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶這四種酶酶解南極磷蝦蛋白的水解效果差異明顯。其中木瓜蛋白酶、中性蛋白酶在四種蛋白酶中水解度較低，胰蛋白酶水解度較高，而堿性蛋白酶的水解效果最好，水解度達到12.19%。因此確定堿性蛋白酶作為試驗用酶。在堿性蛋白酶最適酶解溫度50 ℃，酶解pH為8.0時，酶添加量為0.4%，酶解4 h進行最適料液比的試驗。試驗結果如圖2，從中可以看出，在料液比為1:30（g/mL）時其水解效果最好，水解度達到11.60%。當底物濃度較低時，酶與底物不能很好地結合，水解度隨著濃度的降低而不斷降低；在高濃度時，底物的流動性變差，酶跟底物不能充分接觸，且加水量少造成其低水分活度，抑制了推動其反應所需的自由能，導致水解度下降[12]，根據試驗結果來看，確定料液比為1:30（g/mL）進行后續的單因素試驗

圖1 幾種酶對南極磷蝦蛋白粉的水解效果

圖2 料液比對南極磷蝦蛋白粉水解度的影響

從圖3可以看出，隨著酶解體系pH的升高，水解度也隨之增大，當pH為8時，水解度達到最大，隨著pH的繼續增大，水解度開始下降。堿性蛋白酶的最適pH為8，低于或者高于這一pH條件時，其蛋白酶活力會下降導致酶解能力減弱水解度降低。

圖3 pH對南極磷蝦蛋白粉水解度的影響

從圖4可以看出，隨著酶解溫度的不斷升高，水解度呈現先增大后減小的趨勢，在溫度為45 ℃時水解效果最好，水解度達到13.45%。這是由于隨著溫度的升高，酶活力也在逐漸變大，酶促反應加快，但當超過最適溫度，酶活力開始變小。因此試驗采取45 ℃左右為酶解的最適溫度。

圖4 溫度對南極磷蝦蛋白粉水解度的影響

從圖5可以看出，在酶添加量為0.4%～1.2%時，水解度增加趨勢平緩；在酶添加量為1.2%～1.6%時水解度顯著增加；在酶添加量為1.6%～2.0%時，水解度幾乎保持不變，這是由于底物逐漸被消耗，酶趨于飽和狀態，綜合水解效果和工藝成本的考慮，選取酶添加量為1.6%進行后續試驗。

圖5 酶添加量對南極磷蝦蛋白粉水解度的影響

從圖6可以看出，隨著酶解時間的延長，水解度不斷增加，但當酶解時間超過5 h以后，水解度開始下降。這可能是因為隨著酶解時間的延長，酶活力下降部分酶的失活，而且過度水解導致氨基酸被破環，游離氨基氮含量減少從而導致水解度降低[13]。因此確定酶解時間為5 h比較適宜。

圖6 酶解時間對南極磷蝦蛋白粉水解度的影響

2.2 響應面中心組合試驗及結果

根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken設計原理，取pH、酶添加量、溫度和時間為影響因素，以水解度為響應值，進行四因素三水平響應面試驗，因素水平設置見表1，結果見表2。

根據表2的結果，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2進行多元回歸分析，得到回歸方程：DH=+15.06+0.34A+0.71B+0.34C-0.086D-0.10AB-0.065AC+0.20AD-0.15BC+0.60BD-0.32CD-1.14A2-0.82B2-0.59C2-0.51D2。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平及編碼

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

對試驗所建立的回歸模型進行方差分析，結果如表3所示。由表3方差分析可知，模型極顯著（p=0.009 5＜0.01），失擬項不顯著（p=0.098 2＞0.05），試驗無失擬因素存在，說明該模型與實際擬合程度好。變異系數C.V.=4.76%，變異系數較低，說明試驗的可信度與精密度較高，此次試驗精密度為6.571＞4，在精密度試驗模型中該模型精密度良好。在此試驗設計中，B、A2、B2項均為極顯著（p＜0.01），C2項影響顯著。由表3中F值可以看出，各因素對南極磷蝦蛋白酶解液水解度的影響程度依次是：酶解時間＞酶添加量＞酶解溫度＞初始pH。交互項對酶解效果影響不是很突出。

表3 二次回歸模型及方差分析

各因素之間的交互作用響應面圖如圖7～圖12。響應面圖是響應值對各因素之間所構成的三維圖，因素對響應值的影響程度大小決定了曲線的陡峭程度[14]。由圖7，圖9和圖11可以看出，溫度和時間、溫度和pH、pH和時間這三組的兩兩交互作用對水解效果影響較顯著。由圖8和圖12可以看出，在較低的溫度和較低pH的情況下，堿性蛋白酶的活性較低，通過酶量的增加可以提高酶的水解能力，這與單因素的試驗結果一致。

圖8 溫度和酶添加量交互作用對水解度的影響

圖9 溫度和pH交互作用對水解度的影響

圖10 酶添加量和時間交互作用對水解度的影響

圖11 pH和時間交互作用對水解度的影響

圖12 酶添加量和pH交互作用對水解度的影響

2.3 最佳酶解方案驗證

應用響應面分析法優化酶解工藝，經曲面擬合后，得到的最佳酶解條件為：酶解溫度為45.68 ℃、酶添加量1.67%、酶解時間5.47 h、pH為8.08。在此條件下預測的水解度達到15.27%。為了檢測模型預測的可靠性，驗證試驗過程中采取酶解溫度46 ℃、酶添加量1.7%、酶解時間5.5 h、初始pH為8.08，進行三次預測試驗，測得的水解度平均值為15.41%與理論值預測值15.27%誤差較小，說明該響應面模型可靠。

3 討論與結論

試驗通過響應面試驗設計優化南極磷蝦蛋白的酶解工藝，采用了Box-Behnken試驗設計原理與響應面分析，建立了酶解工藝的二次多項式數學模型。通過對模型的響應面分析，了解各因素及其交互作用對南極磷蝦蛋白水解度的影響[15]。其中時間是影響南極磷蝦粉酶解的關鍵因素。從響應曲面圖可以看出來，溫度和時間、溫度和pH、pH和時間，這三組交互作用明顯，其他因素之間的交互作用不太明顯。最后，對二次模型的分析獲得了酶解南極磷蝦蛋白的最佳工藝條件，即酶解溫度為45.68 ℃、酶添加量1.67%、酶解時間5.47 h、pH為8.08，在此條件下，水解度可達15.27%。經驗證試驗可知，該模型能很好地預測南極磷蝦蛋白的水解度。