氣相色譜串聯三重四級桿質譜測定焦糖色中4-甲基咪唑

王愛軍

上海食品科技學校（上海 201599）

焦糖色素是一種廣泛使用的食品色素，其色澤口感好，且性質較為穩定，在調味品、飲料等食品中應用廣泛[1-2]。氨法生產焦糖色素時會產生4-甲基咪唑（4-MI）。4-MI為神經毒性物質，對小鼠的LD50值為370 mg/kg[3-4]。此外，4-MI可致驚厥作用，能誘發癲癇癥、肝癌或甲狀腺腫瘤[3,5-8]。為了加大對食品質量安全的監管力度，建立快速有效地檢測焦糖色中4-MI含量的方法具有重要意義。

檢測4-MI較為經濟的方法是紙層析法[9-10]，這種方法是利用目視定量，其誤差大。使用分光光度法測定，操作繁瑣，雜質干擾大，難以準確定性定量[5]。GB 1886.64—2015[11]將焦糖色的檢驗方法變更為氣相色譜法，然而無論是使用FID檢測器[11]或NPD檢測器[12-13]，樣品富集倍數高，定量結果不準確。高效液相色譜法需要對樣品進行衍生，分析結果重復性低[14]。使用串接質譜能夠有效降低雜質干擾，獲得較低的檢出限[15]，前處理使用柱層析，增加前處理的成本和時間。

QuEChERS前處理方法主要應用于農藥及獸藥殘留檢測，逐漸被應用于微量化合物的分析測定，具有針對性[16]。試驗基于QuEChERS前處理技術，建立適合測定焦糖色中4-MI的快速前處理方法。同時重新優化質譜條件，提高檢測準確性。該方法主要針對檢驗機構對焦糖色中4-MI含量進行快速測定和判定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

焦糖色（普通法生產，市售）；4-甲基咪唑標準品（98%，美國Acros Organics）；乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、無水硫酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）；硅藻土（美國Supelco）；實驗用水為三級水。

氣相色譜儀（Agilent，7890B）；三重四級桿質譜儀，配有電子轟擊離子源（EI）（Agilent，7000）；旋渦混合器（Vortex Mixer QL-866）。

1.2 樣品前處理

準確稱取2 g（精確到0.000 1 g）焦糖色于50 mL旋蓋離心管，加入2 mL 0.3 moL/L的NaOH溶液，攪拌均勻，加入2.5 g硅藻土后旋緊蓋子劇烈振蕩，使硅藻土與試樣混合均勻，繼續加入20 mL乙酸乙酯后旋緊蓋子于漩渦振蕩儀振蕩50 s，取上清液通0.45 μm的微孔濾頭過濾，待氣相色譜-串聯質譜儀分析用。

1.3 標準溶液配制

準確稱取約0.100 43 g 4-MI標準品，加入二氯甲烷充分溶解后轉移至100 mL容量瓶中，加二氯甲烷定容，配置成濃度1.00 mg/mL的標準儲備液，于4 ℃條件下保存。準確移取上述儲備液，加二氯甲烷配置成1 mL上機液，用于標準曲線的配置。

1.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱Agilent HP-5MS UI（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱；載氣He（99.999%）；碰撞氣N2；恒流模式，柱流量1.5 mL/min；不分流進樣，進樣量1 μL；進樣口溫度220 ℃；柱初始溫度60 ℃，保持2 min，程序升溫以20 ℃/min至140 ℃，后運行柱流量3 mL/min，300 ℃保持8 min。

質譜條件：離子源，EI源；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；傳輸線溫度300 ℃；電子能量70 eV；溶劑延遲4 min；掃描方式，多反應監測模式（MRM）。母離子、子離子、碰撞能量、保留時間見表1。

表1 母離子、子離子、碰撞能量及保留時間

1.5 測定方法

取樣品和標準溶液各1 μL，通過自動進樣器注入氣相色譜-串聯質譜儀中進行分析，得到4-MI產物離子圖（見圖1），以保留時間和二級質譜特征碎片離子m/z 54.1、55.0定性，以定量離子m/z 55.0的峰面積外標法計算樣品中4-MI含量。

2 結果與分析

2.1 二級質譜條件優化

4-MI分子量82，全掃描獲得的質譜圖（見圖2）主要m/z有82.0，81.0和54.1，其中選擇m/z較大的碎片82.0和81.0優化碰撞能量（見表2）。

從表2看出，m/z 54在各種條件下均能獲得較高豐度，該碎片容易獲得，因而抗干擾能力弱。m/z 55僅在選取母離子m/z 82.0時產生，該碎片能更好地體現4-MI特征，并且在碰撞能量5 V時相對m/z 54有較高豐度，因而選擇m/z 82.0→55.0（碰撞能量5 V）為定量離子。為了更多地體現4-MI碎片特征，選取另一母離子的離子對m/z 81.0→54.1作為定性離子，在碰撞能量25 V時m/z 54.1豐度最接近定量離子豐度，定性準確性較好，因而選擇m/z 81.0→54.1（碰撞能量25 V）為定性離子。

圖1 4-MI產物離子圖

圖2 4-MI全掃描質譜圖

表2 4-MI二級質譜優化結果

2.2 浸提溶劑種類的優化

分別稱取等量焦糖色，與2.5 g硅藻土混合均勻后，加入20 mL提取溶劑，立即渦旋萃取30 s，比較正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈的浸提效果（見表3）。結果表明，乙酸乙酯提取效果最佳，30 s萃取回收率達77.5%。此外，甲醇、乙醇極性較大，浸提后提取液顏色呈棕色，無法有效去除雜質，所以不適合作為浸提溶劑。

2.3 提取時間的優化

分別考察不同渦旋時間對4-MI提取能力。如圖3所示，提取時間在5～40 s之間，提取液中4-MI與提取時間呈正相關，提取時間越長，提取液中4-MI含量越高；提取時間大于40 s，隨著提取時間延長，提取液中4-MI含量保持穩定，說明提取達到動態平衡，繼續增加提取時間對提取率增加沒有效果。為保證提取率穩定，最佳提取時間為50 s。

表3 不同種類溶劑浸提效果

圖3 渦旋時間對4-MI提取效果

2.4 線性范圍、定量限、精密度、回收率

配制0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和20.0 μg/mL 4-MI標準系列濃度進行測定，以定量離子峰面積S為縱坐標，質量濃度c（μg/mL）為橫坐標繪制標準工作曲線（強制過原點），4-MI標準溶液在范圍內，線性回歸方程為S=323.739 270c，相關系數為0.999 7，線性較好。按照3倍性噪比計算檢出限，儀器檢出限為0.5 μg/mL，稱樣量為2 g時，方法檢出限為5 mg/kg，滿足焦糖色中4-MI含量檢驗要求（限量值200 mg/kg[11]）。對空白焦糖色素樣品加標，考察了3個加標水平（5，100和200 mg/kg），每個水平平行試驗6次，計算測得樣品的加標回收率為78.3%～91.7%，通過相對標準偏差（RSD）衡量試驗精密度，RSD值為2.11%～7.12%（見表4），符合痕量分析要求。

表4 4-MI加標回收率及相對標準偏差

3 結論

試驗建立焦糖色中4-MI含量檢測方法。在前處理方面，針對焦糖色基質采用硅藻土吸附劑進行凈化，應用QuEChERS技術對微量化合物進行分析測定，且經過方法優化后，對4-MI提取和凈化效果有明顯針對性，降低前處理的成本和時間。由于4-MI分子量低，特征峰抗干擾能力弱，單級質譜仍無法有效地排除小分子雜質的干擾。應用串接質譜能夠有效降低雜質干擾，并且選取僅在選取母離子m/z 82.0時產生m/z 82.0→55.0（碰撞能量5 V）為定量離子，該碎片能更好地體現4-MI特征，抗基質干擾能力強。

基于QuEChERS前處理技術，建立適合測定焦糖色中4-MI的快速前處理方法。同時重新優化質譜條件，利用更多母離子信息對目標物4-MI進行準確定性，進一步降低雜質干擾，從而減少濃縮倍數，簡化前處理，提高檢測準確性。該方法主要針對檢驗機構對焦糖色中4-MI含量進行快速測定和判定。