催化動力學光度法測定食品中的痕量硒

郭楠楠，段秋虹

鄭州科技學院，鄭州市食品安全快速檢測重點實驗室（鄭州 450064）

硒是人和動物所必需的微量元素[1]，硒在自然界中存在的形式是無機硒和有機硒，近幾年，含硒樣品的種類越來越多，檢測的手段也各有不同，中華人民共和國國家標準GB 5009.93—2017《食品安全國家標準 食品中硒的測定》中規定了食品中硒含量的測定方法，主要有氫化物原子熒光光譜法、分光光度法、熒光分光光度法和電感耦合等離子體質譜法等[2]。與這些測定方法相比，催化動力學光度法具有儀器簡單、測定費用較低、靈敏度高等優點[3]，因此，試驗探討了催化動力學光度法對食品中硒含量的測定條件及動力學條件，建立一種測定食品中痕量硒的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳、核桃、紅小豆（市售）；100 mg/L硒標準溶液（用時稀釋至0.1 μg/mL，中國·派尼化學試劑廠）；亞甲藍（鄭州派尼化學試劑廠）；溴酸鉀（鄭州派尼化學試劑廠）；硝酸溶液（鄭州派尼化學試劑廠）；鹽酸（鄭州派尼化學試劑廠）；硫酸（洛陽昊華化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

HH-S型水浴鍋（0～100 ℃），鄭州長城科工貿有限公司；101-OABS電熱鼓風干燥箱，上海科恒實業發展有限公司，UV-4802紫外可見光分光光度計，上海悅豐儀器儀表有限公司；電子萬用爐，北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

將黑木耳、核桃、紅小豆用水洗凈，在65～70 ℃條件下，在烘箱中烘干樣品，粉碎完全。用電子天平稱取1.000 g粉碎好的樣品于錐形瓶中，添加少量的水潤濕，再加入25 mL 1:4的高氯酸-硝酸混酸，在室溫下靜置過夜，在錐形瓶中加入2～3粒玻璃珠，在可調式電熱爐上緩慢加熱，并補加硝酸，直至試樣溶液呈透明。溶液冷卻后，加入20 mL 1:1的硫酸溶液，后轉入分液漏斗中，依次加入1.5 g的溴化鉀（溴化鉀需要先用少量的水溶解）、3 mL的磷酸溶液，混勻后加入25 mL的苯，振蕩1 min，分層后將水相移入另一份液漏斗中，再加入25 mL的苯重復萃取一次，合并有機相，用50 mL的水反萃取硒兩次，將兩次的有機相合并于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度。

1.3.2 樣品分析方法

取兩根相同的25 mL的具塞的比色管，在其中的一根中加入1.5 mL的硒標準使用液做催化反應，另外一根中不加硒標準使用液，再依次分別加入2.00 mL硝酸溶液、2.00 mL亞甲藍溶液、2.50 mL溴酸鉀溶液，再加入蒸餾水，稀釋至刻度線，振搖混合均勻，置于75 ℃水浴中加熱5 min，立即取出置于流水中冷卻至室溫。冷卻至室溫后，以水作參比，用1 cm比色皿在665 nm處分別測定出非催化反應溶液的吸光度A0和催化反應溶液的吸光度A，計算出ΔA。

1.4 樣品中硒含量的測定

在比色管中依次加入2.00 mL硝酸、2.00 mL亞甲藍溶液、2.5 mL溴酸鉀溶液，加水稀釋至25 mL測定它的吸光度，記為空白值。吸取5.00 mL經處理的樣品消化液于25 mL的比色管中，再在比色管中依次加入2.00 mL硝酸溶液、2.00 mL亞甲藍溶液、2.5 mL溴酸鉀溶液，用蒸餾水稀釋至刻度25 mL，輕輕地搖勻并混合均勻，將搖勻的比色管置于75 ℃的恒溫水浴箱中連續加熱5 min，水浴加熱完成后，在冷水的作用下，將比色管置于冷水流下冷卻至室溫。再用紫外分光光度計測定它的吸光度。在待測樣液中分別加入0.1和0.2 μg的硒標準樣液，測定其吸光度，計算樣品中硒的含量及回收率。

1.5 樣品中硒含量的計算

根據標準曲線方程計算樣品中硒濃度，根據硒的濃度計算出樣品中硒的含量。

式中：X為試樣中硒含量，mg/kg；ρ為試樣中硒的質量濃度，mg/kg；m為試樣質量，g；V1為試樣用比色皿的體積，mL；V2為樣品消解后定容體積，mL；V3為移取消化液的體積，mL。

2 結果與分析

2.1 波長對硒吸光度的影響

用紫外分光光度計測定不同波長情況下，溶液的不同的吸光度。在紫外分光光度計上的多波長設置中，分別設置波長655，660，665，670，675和680 nm，按1.3.2進行試驗。觀察試驗現象并記錄試驗數據，具體結果見圖1。催化反應與非催化反應的最大吸收波長為665 nm處，可看出在665 nm處為最適合的測定波長。

2.2 試驗條件的選擇及工作曲線的確定

2.2.1 酸度的選擇

用吸量管分別吸取1.00，1.50，2.00，2.50和3.00 mL 0.025 mol/L的硝酸溶液于5根25 mL比色管中。按照試驗方法測定其吸光度。結果見圖2。硝酸的最適用量為2.00 mL，此時ΔA最大，所以試驗選擇硝酸的用量為2.00 mL。

圖1 吸收波長對硒吸光度的影響

圖2 硝酸用量對反應的影響

2.2.2 亞甲藍用量的選擇

固定其他的條件，分別取0.50，1.00，1.50，2.00，2.50和3.00 mL亞甲藍溶液，具體結果見圖3。在亞甲藍用量不斷增加的情況下，吸光度也在不斷地增加，ΔA先緩慢增加，當亞甲藍的用量為2.00 mL時，ΔA最大，隨后ΔA降低。試驗結果表明：亞甲藍溶液的最適使用量為2.00 mL。

圖3 亞甲藍用量對反應的影響

2.2.3 溴酸鉀用量的選擇

固定其他的條件，分別吸取1.50，2.00，2.50，3.00，3.50和4.00 mL溴酸鉀溶液。具體結果見圖4。由圖4可知，ΔA的變化隨著溴酸鉀加入量的增加而增大，溴酸鉀在2.50 mL后增長變緩，所以選擇溴酸鉀用量2.50 mL。

圖4 溴酸鉀用量對反應的影響

2.2.4 反應溫度的選擇

反應溫度發生改變，吸光度隨之發生變化。為了得出溫度對體系的影響，將其他條件固定，分別選取不同的溫度（65，70，75，80和85 ℃），結果見圖5。隨著反應溫度的不斷升高，ΔA也在不斷地升高，在75 ℃時達到最大值，試驗結果表明：試驗在室溫下幾乎不發生反應，故選擇最適反應溫度75 ℃。

圖5 溫度對反應的影響

2.2.5 水浴時間的選擇

其他條件固定，設定水浴加熱時間2，3，4，5，6和7 min，具體結果見圖6。由圖6可知，ΔA隨著反應時間的不同先變化不明顯后來又增大而后又減小，此現象發生的原因可能是時間差的選擇過小，導致變化不明顯。在5～6 min之間，ΔA處于上升期，考慮在5 min時吸光度較大，故選擇水浴時間5 min。

圖6 水浴時間對反應的影響

2.2.6 工作曲線

在確定了最佳反應條件后，固定其他條件不變，通過改變硒的加入量進行試驗，分別取0，1，2，3，4和5 mL的硒標準使用液。由圖7可知，工作曲線回歸方程為y=5.742 9x-0.002 7，相關系數R2=0.998 6，方法的準確度及靈敏性較好，適用于測定食品中的痕量硒。

圖7 標準曲線

2.3 樣品結果分析

按1.4小節所述方法，分別檢測黑木耳、核桃、紅小豆中硒含量，具體結果見表1～表3。

表1 黑木耳含硒量的結果分析

表2 核桃含硒量的結果分析

表3 紅小豆含硒量的結果分析

通過上述分析可以得出，試驗所選用的最適波長為665 nm，稀硝酸的用量為2.00 mL，溴酸鉀的用量為2.50 mL，亞甲藍的用量為2.00 mL，在75 ℃水浴中加熱5 min，黑木耳的含硒量為3.78 μg/100 g，核桃的含硒量為4.24 μg/100 g，紅小豆的含硒量約為3.76 μg/100 g。測定結果的相對標準偏差在10%左右，回收率在80%～110%之間，符合國標規定，結果較好。

2.4 催化動力學光度法與熒光分光光度法測定結果比較

取樣品黑木耳、核桃、紅小豆，在相同的消化條件下，分別使用催化動力學光度法和國標GB 5009.93—2017第二法熒光分光光度法，進行6次平行測定，以此來檢測方法的精密度，最終測定的相對標準偏差均小于0.1，符合誤差允許的范圍。對兩種方法進行F檢驗，所得F值均小于F表（p=95%），說明兩種方法在精密度上不存在顯著性差異。具體結果見表4。

表4 方法的精密度

2.5 測定方法的檢出限及定量限

對試劑空白進行11次平行測定，按公式MDL=3×S計算檢出限MDL，按公式MQL=10×S計算定量限MQL，式中S為重復測空白中硒11次的標準偏差。結果見表5。

表5 檢出限與定量限

3 結論

通過上述分析可得出結論：催化動力學光度法測定食品中硒含量的最適波長為665 nm，稀硝酸的用量為2.00 mL，溴酸鉀的用量為2.5 mL，亞甲藍的用量為2.00 mL，在75 ℃水浴中加熱5 min，黑木耳的含硒量為3.78 μg/100 g，核桃的含硒量為4.42 μg/100 g，紅小豆的含硒量約為3.78 μg/100 g。加標回收率在80%～110%之間，檢出限為0.015 μg/L，方法與國標第二法相比在精密度上不存在顯著性差異。與國標中方法相比，方法操作簡單，所用儀器價廉易得，準確性較高，成本花費較少。