利用超臨界CO2流體萃取小球藻精油中活性成分的工藝

陳金明，張文煥，羅蘇芹，戴宏杰，黃惠華*

1. 廣州聯(lián)豐香料科技有限公司（廣州 510663）；2. 吉百利糖果（廣州）有限公司（廣州 510730）；3. 華南理工大學食品科學與學院（廣州 510640）

小球藻（Chlorella）屬綠藻門（Chlorophyta）、綠球藻目（Chlorococcales）、小球藻科（Chlorellaceae）中一個重要的屬，是一種單細胞真核微藻[1]。小球藻在自然界分布較廣，在海洋、湖泊、池塘、溝渠、潮濕的土壤、樹皮等環(huán)境中均可生長繁殖，但以淡水環(huán)境為主[2]。小球藻的光合效率高、生長繁殖快、適應性強，具有超量吸收某些有機物和重金屬的能力[3-4]。小球藻細胞中的色素主要為葉綠素和類胡蘿卜素，以干物質計，其葉綠素含量通常為4%～6%，胡蘿卜素含量為0.044 1%～0.044 8%，類葉黃素含量為0.267%～0.310%[3]。葉黃素的提取是葉黃素規(guī)模化生產中十分重要的下游環(huán)節(jié)，與葉黃素的最終產品品質和生產成本密切相關。目前提取葉黃素最常見的方法是通過有機溶劑提取，但存在萃取效率低、有機試劑殘留等問題，其應用性受到很大的限制[5]。

超臨界流體萃取技術是近20年來國際上迅速發(fā)展起來的最先進的物理萃取技術，已廣泛應用于食品、香料、石油、化工、醫(yī)藥等行業(yè)，其中CO2是最常用的超臨界流體[6]。在國外已有利用超臨界CO2萃取小球藻活性成分的研究報道[7-10]，但是在國內，這方面的研究相對較少[11-12]。試驗以萃取溫度、萃取壓力、萃取時間和夾帶劑用量為自變量，以精油得率和葉黃素濃度為因變量，通過響應面優(yōu)化超臨界CO2萃取小球藻精油工藝，以期為超臨界CO2萃取小球藻精油及其活性成分提供基礎數(shù)據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻，購于CSIRO Marine Laboratory（Hobart，Australia）；無水乙醇，分析純，購于天津市百市化工有限公司；乙腈，色譜純，購于天津四友精細化工有限公司；甲醇，色譜純，購于天津四友精細化工有限公司；葉黃素，購于美國Sigma公司。

1.2 設備與儀器

DHG-9123 A超臨界CO2萃取設備，廣州輕工業(yè)研究所；高效液相色譜儀，美國戴安公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小球藻精油提取技術路線

小球藻原料的預處理：購買原料→在低溫（40～50 ℃）下烘干→稱取藻粉100 g→加入一定體積的無水乙醇→密封、避光浸泡24 h。

超臨界CO2萃取小球藻精油流程：

1) SC(L)FE-CO2流程：CO2鋼瓶→冷凍系統(tǒng)→貯罐→高壓泵→萃取釜→解析釜→冷凍系統(tǒng)（循環(huán)）。

2) 真空濃縮：萃取物→0.09 MPa，40 ℃下濃縮，去掉夾帶劑無水乙醇→小球藻精油（深綠色油狀物）。

1.3.2 單因素試驗設計

影響超臨界CO2萃取效果的主要因素有：萃取壓力（MPa）、萃取溫度（℃）、萃取時間（h）、夾帶劑用量（mL）以及CO2流量（L/min）。考慮到萃取時的成本和萃取儀器的穩(wěn)定性，單因素試驗時未將CO2流量列入考察范圍而將其固定在2.0 L/min。試驗主要研究小球藻中的活性成分，所以確定以小球藻精油得率（g/100 g小球藻粉）以及油中的葉黃素濃度（mg/g小球藻精油）為考察指標，研究了萃取壓力（7～30 MPa）、萃取溫度（25～60 ℃）、萃取時間（1.0～6.0 h）、夾帶劑無水乙醇用量（0～300 mL）對小球藻精油得率和葉黃素濃度的影響。

1.3.3 響應面試驗設計

小球藻精油得率響應面優(yōu)化：在單因素試驗結果基礎上進行響應面設計，選取顯著性影響因素萃取壓力、萃取溫度和夾帶劑無水乙醇用量三個因素為自變量，以小球藻精油得率為因變量進行三因素三水平的響應面設計試驗（見表1）。采用Design-Expert 8.0.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，并預測最佳萃取工藝。

表1 小球藻精油得率的響應面分析設計

小球藻精油葉黃素含量響應面優(yōu)化：在單因素試驗結果基礎上進行響應面設計，選取顯著性影響因素萃取壓力、萃取溫度、萃取時間和夾帶劑無水乙醇用量四個因素為自變量，以小球藻精油葉黃素濃度為因變量進行四因素三水平的響應面設計試驗（見表2）。采用Design-Expert 8.0.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，并預測最佳萃取工藝。

表2 葉黃素濃度的響應面分析設計

1.3.4 葉黃素含量分析

應用高效液相色譜進行葉黃素含量的分析[13]。采用Dionex HPLC系統(tǒng)測定，選用Symmetry C18色譜柱（5 μm；250 mm×4.6 mm），流動相為甲醇-乙腈（9:1，V/V），流動相流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫25 ℃，PDA 996檢測器在440 nm與470 nm處檢測葉黃素，以Sigma公司的葉黃素作為標樣進行葉黃素定量分析。得到回歸方程Y=8.766 8X-40.546，其中Y為峰面積（R2=0.999 2）。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 萃取壓力對小球藻精油得率與葉黃素濃度的影響

稱取小球藻粉100 g，萃取溫度為40 ℃，萃取時間為3 h，夾帶劑無水乙醇為200 mL（液固比為2:1（mL·g）），萃取壓力分別設定為7，10，15，20，25和30 MPa，進行萃取，每次萃取試驗重復進行3次。小球藻精油得率分別為：3.89±0.13，4.85±0.12，5.11±0.07，5.80±0.09，5.48±0.07和5.13±0.06 g/100 g（見圖1（a））；小球藻精油中葉黃素濃度分別為：4.62±0.09，4.80±0.09，5.61±0.07，6.36±0.08，5.28±0.05和5.55±0.05 mg/g小球藻精油（見圖1（b））。單因素方差分析結果表明萃取壓力對小球藻精油得率和葉黃素濃度均有顯著性的影響，從圖1（a）中可知對精油得率影響最大的范圍為15～25 MPa之間，從圖1（b）中可知對葉黃素濃度影響最大的范圍為10～25 MPa之間。

2.1.2 萃取溫度對小球藻精油得率與葉黃素濃度的影響

稱取小球藻粉100 g，萃取壓力為20 MPa，萃取時間為3 h，夾帶劑無水乙醇用量為200 mL（液固比為2:1（mL·g）），萃取溫度分別設定為25，30，35，40，50和60 ℃，進行萃取，每次萃取試驗重復進行3次。小球藻精油得率分別為：4.53±0.10，4.80±0.09，5.09±0.07，5.24±0.07，4.71±0.10和3.60±0.07 g/100 g（見圖1（c））；小球藻油中葉黃素濃度分別為：5.92±0.10，6.26±0.16，6.14±0.11，6.89±0.08，6.05±0.13和5.82±0.11 mg/g小球藻精油（見圖1（d））。單因素方差分析結果表明萃取溫度對小球藻精油得率和葉黃素濃度均有顯著性的影響，從圖1（c）和（d）中可知對精油得率和葉黃素濃度影響最大的范圍均在30～50 ℃之間。

2.1.3 萃取時間對小球藻精油得率與葉黃素濃度的影響

稱取小球藻粉100 g，萃取壓力為20 MPa，萃取溫度為40 ℃，夾帶劑無水乙醇用量為200 mL（液固比為2:1（mL·g）），萃取時間分別設定為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 h進行萃取，每次萃取試驗重復進行3次。小球藻精油得率分別為：5.43±0.06，5.55±0.05，5.67±0.06，5.71±0.07，5.70±0.07和5.60±0.06 g/100 g（見圖1（e））；小球藻精油中葉黃素濃度分別為：5.34±0.07，6.33±0.07，6.89±0.08，6.81±0.07，6.63±0.09和6.80±0.07 mg/g小球藻精油（見圖1（f））。單因素方差分析結果表明萃取時間對小球藻精油的得率沒有顯著性的影響，后續(xù)試驗將萃取時間固定在3.0 h。萃取時間對葉黃素濃度有顯著性的影響，從圖1（f）中可知對葉黃素濃度影響最大的范圍為2.0～5.0 h之間。

2.1.4 夾帶劑無水乙醇用量對小球藻精油得率與葉黃素濃度的影響

稱取小球藻粉100 g，萃取壓力為20 MPa，萃取溫度為40 ℃，萃取時間為3 h，夾帶劑無水乙醇分別設定為0，50，100，150，200和300 mL，即液固比分別為0，0.5:1，1:1，1.5:1，2:1和3:1（mL/g）進行萃取，每次萃取試驗重復進行3次。小球藻精油得率分別為：0.48±0.09，2.81±0.08，5.00±0.12，5.84±0.08，5.67±0.07和5.56±0.06 g/100 g（見圖1（g））；小球藻精油中葉黃素濃度分別為：1.79±0.09，5.25±0.07，5.62±0.08，6.87±0.12，6.85±0.11和5.46±0.10 mg/g小球藻精油（見圖1（h））。單因素方差分析結果表明夾帶劑無水乙醇用量對小球藻精油得率和葉黃素濃度均有顯著性的影響，從圖1（g）和圖1（h）中可知對精油得率和葉黃素濃度影響最大的范圍均在100～300 mL之間。

圖1 萃取壓力、萃取溫度、萃取時間和夾帶劑用量分別對小球藻精油得率和葉黃素濃度的影響

2.2 響應面分析優(yōu)化試驗

2.2.1 小球藻精油得率響應面設計試驗與結果分析

運用Design-Expert 8.0.5軟件進行響應面數(shù)據(jù)分析，小球藻精油得率響應面試驗結果見表3。

各因素經(jīng)過回歸擬合后，建立的數(shù)學模型為：Y=5.26+0.64A-0.47B+0.55C-0.071AB-0.32AC+0.41BC-0.38A2-0.54B2-0.48C2。其中，Y為小球藻精油得率（g/100 g），A為萃取壓力（MPa），B為萃取溫度（℃），C為夾帶劑無水乙醇用量（mL）。

由表4方差分析可知，整體模型的“Prob＞F”值小于0.000 1，表明該二次方程模型高度顯著。失擬項不顯著，說明非試驗因素對精油得率影響較小，該模型擬合良好。單因素A（萃取壓力）、B（溫度）以及C（夾帶劑無水乙醇）均有高度顯著的影響；AC、BC之間的交互作用影響均顯著，而AB之間的交互作用影響不顯著（見表3）。根據(jù)回歸方程一次項系數(shù)絕對值的大小可得到三個因素對精油得率影響大小順序為A＞C＞B，即萃取壓力＞夾帶劑用量＞萃取溫度。

表3 小球藻精油得率的響應面分析試驗結果

表4 小球藻精油得率的回歸分析結果

圖2（a）是在夾帶劑無水乙醇用量為200 mL（液固比2:1（mL·g））時，萃取壓力與溫度對小球藻精油得率影響作用的響應面曲線。從圖中可知，在較低的溫度水平下，小球藻精油的得率隨著溫度的上升而增大，這是因為隨著溫度的上升，溶質的傳質系數(shù)增大；而在較高的溫度水平下，由于隨著溫度的升高，CO2的密度下降，導致了小球藻精油的得率隨著溫度的上升而下降的現(xiàn)象出現(xiàn)。同樣，在較低的壓力水平下，小球藻精油的得率隨著壓力的上升而增大并到達最高點，這是由于隨著壓力的增大，CO2流體的密度增大從而導致小球藻精油的溶解度增加[14]；小球藻精油得率出現(xiàn)最高點后開始回落，這可能是由于在高壓低溫狀態(tài)下，物料被壓緊密度增大而且在低溫下物料出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，導致了傳質速度的下降；或者在高壓狀態(tài)下，出現(xiàn)了溶質與溶劑間的互相排擠的現(xiàn)象，這些原因均會導致小球藻精油得率的下降[15]。圖2（b）是在萃取溫度為40 ℃，萃取壓力與夾帶劑無水乙醇對小球藻精油得率影響作用的響應面曲線。在高壓力水平下，無水乙醇用量在較低水平下時，小球藻精油的得率隨著無水乙醇用量的增加而提高，這是因為無水乙醇的增加使得越來越多的小球藻精油溶出，濃度增大，傳質速度增加；而無水乙醇在較高的水平時，小球藻精油得率隨著用量的增加而降低，這可能是由于過量的無水乙醇使得小球藻精油濃度下降，傳質速度下降或者是在高壓狀態(tài)下產生了溶質與溶劑間的互相排擠的現(xiàn)象[15]。

圖2 萃取壓力與溫度和夾帶劑用量和萃取壓力對小球藻精油得率交互作用的響應面圖

根據(jù)所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)最佳化分析，得到小球藻精油得率最高所需的參數(shù)條件為：萃取壓力24.16 MPa，萃取溫度35.59 ℃，夾帶劑無水乙醇用量155.42 mL（液固比約為1.55:1 mL/g）。此時小球藻精油得率為5.66 g/100 g藻粉。根據(jù)實際的應用情況，以萃取壓力24 MPa，萃取溫度36 ℃，夾帶劑無水乙醇用量155 mL（液固比為1.55:1 mL/g）進行萃取，重復3次，得到小球藻精油得率為5.68±0.06 g/100 g藻粉，預測值與實際值無顯著差異，表明預測結果實際可行。

2.2.2 小球藻葉黃素濃度響應面設計試驗與結果分析

運用Design-Expert 8.0.5軟件進行響應面數(shù)據(jù)分析，小球藻精油萃取工藝葉黃素濃度的響應面設計試驗的結果見表5。

各因素經(jīng)過回歸擬合后，建立的數(shù)學模型為：Y=6.92-0.042A-0.18B-0.12C+0.13D+0.12AB-0.13AC-0.38AD-0.03BC+0.016BD+0.27CD-0.36A2-0.12B2-0.26C2-0.29D2。其中，Y為葉黃素濃度（mg/g小球藻精油），A為萃取壓力（MPa），B為萃取溫度（℃），C為萃取時間（h），D為夾帶劑無水乙醇用量（mL）。

由表6方差分析可知，整體模型的“Prob＞F”＜0.000 1，表明該二次方程模型高度顯著。失擬項不顯著，說明該模型擬合良好。單因素A（萃取壓力）、B（萃取溫度）、C（萃取時間）和D（夾帶劑無水乙醇用量）均有高度顯著的影響；AB、AC、AD、BC和CD之間的交互作用影響均顯著，而BD之間的交互作用影響不顯著（見表6）。根據(jù)回歸方程一次項系數(shù)絕對值的大小可得到四個因素對葉黃素濃度影響大小順序為B＞D＞C＞A，即萃取溫度＞夾帶劑用量＞萃取時間＞萃取壓力。

表5 葉黃素濃度的響應面分析試驗結果

表6 葉黃素濃度的回歸分析結果

圖3（a）為在萃取2.5 h和夾帶劑無水乙醇為150 mL（液固比1.5:1（mL·g））時，萃取壓力與溫度對小球藻精油中葉黃素濃度影響作用的響應面曲線。從圖中可知，在較低的壓力水平下，葉黃素濃度隨著壓力的上升而增大并到達最高點，這是由于隨著壓力的增大，CO2流體的密度增大從而導至大量的葉黃素隨著小球藻油一起溶出，葉黃素濃度增加[16]；在較高的壓力水平下，葉黃素濃度隨著壓力的增加而降低，從前面的分析可知，在較高的壓力水平下，小球藻油的得率也是隨著壓力的增加而降低，所以這也可能是由于在高壓低溫狀態(tài)下，物料被壓緊密度增大而且在低溫下物料出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，導致了傳質速度的下降，而且葉黃素傳質速度下降的速率更快；或者在高壓狀態(tài)下，出現(xiàn)了溶質與溶劑間的互相排擠的現(xiàn)象[15]。至于溫度對葉黃素濃度的影響，在低溫階段，葉黃素濃度很快到達最高點，而低溫度水平階段小球藻油的得率會隨著溫度的提高而上升，說明了在低溫的初始階段葉黃素以比小球藻精油更快的速度傳質，隨后速率變慢；在高溫水平下，葉黃素濃度隨著溫度的提升而下降，與小球藻精油的溶出趨勢相近。

圖3（b）為在40 ℃和無水乙醇用量為150 mL（液固比1.5:1）時，壓力與萃取時間對小球藻精油中葉黃素濃度影響作用的響應面曲線。壓力對葉黃素濃度的影響已在圖3中說明，而在萃取時間上，葉黃素濃度隨著時間的延長而增加，在萃取約3 h后，葉黃素濃度隨著時間的延長而降低。這主要是因為長時間的萃取，會有大量其他組分溶出使得葉黃素濃度降低[16]。

圖3（c）為在40 ℃和萃取2.5 h時，壓力與無水乙醇用量對小球藻精油中葉黃素濃度影響作用的響應面曲線。壓力對葉黃素濃度的影響已在圖3中說明。在較低壓力水平下，葉黃素濃度隨著無水乙醇用量的增加而大幅提高，到達最高點后開始回落，在相同階段，小球藻精油的得率也隨著無水乙醇用量的增加而提高，但是增幅緩慢，所以在該階段中與其它組分相比，葉黃素以較大的傳質速度溶出，使得濃度大幅提高；而在較高的壓力水平下，葉黃素濃度在較低的無水乙醇用量下變化不大，但是隨著無水乙醇用量的進一步提高，葉黃素濃度急劇下降，這是因為在相同階段下，小球藻精油的得率快速增大并達到最高點，即相對較多的其他組分溶出，最終使得葉黃素濃度下降[16]。

根據(jù)所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)最佳化分析，得到小球藻油中葉黃素濃度最高所需的參數(shù)條件為：壓力15.76 MPa，萃取溫度30 ℃，萃取時間2.77 h，無水乙醇用量198.94 mL（液固比約1.99:1（mL·g））。此時葉黃素濃度為7.09（mg/g小球藻精油）。根據(jù)實際的應用情況，以壓力16 MPa，萃取溫度30 ℃，萃取時間2.8 h，夾帶劑無水乙醇用量199 mL（液固比1.99:1（mL·g））進行萃取，重復3次，得到葉黃素濃度為7.13±0.10（mg/g小球藻精油），預測值與實際值無顯著差異，表明預測結果實際可行。

圖3 萃取壓力與萃取溫度、萃取壓力與萃取時間、萃取壓力與夾帶劑用量對葉黃素濃度的交互作用的響應面圖

3 結論

1) 單因素試驗分析結果：通過對單因素萃取壓力、萃取溫度、萃取時間以及無水乙醇用量的顯著性檢驗，除萃取時間以外，其它三因素均對小球藻精油得率有顯著性的影響；四個因素均對葉黃素濃度有顯著性影響，根據(jù)各因素的最大影響范圍確定了對響應面設計試驗的水平范圍，分別為壓力15～25 MPa，溫度30～40 ℃，時間2～4 h，無水乙醇用量100～200 mL。

2) 通過對小球藻精油得率的三因素三水平響應面設計試驗分析，小球藻精油的最佳萃取工藝為：萃取壓力24 MPa，萃取溫度36 ℃，無水乙醇用量155 mL。此時得到小球藻精油得率為5.68±0.06（g/100 g藻粉）。

3) 通過對葉黃素濃度的四因素三水平響應面設計試驗分析，葉黃素的最佳萃取工藝為：萃取壓力16 MPa，萃取溫度30 ℃，萃取時間2.8 h，無水乙醇用量199 mL進行萃取。此時，得到葉黃素濃度為7.13±0.10（mg/g小球藻精油）。