miR-21-5p過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠高氧性急性肺損傷形態(tài)學(xué)的影響

劉國(guó)躍，王 勇，陳 淼

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科二病區(qū)，貴州 遵義 563099)

重癥加強(qiáng)治療病房(Intensive Care Unit，ICU)是各類(lèi)危重患者救治的地方，尤其是呼吸衰竭后行機(jī)械通氣的患者，而此類(lèi)患者常常需要高濃度氧療，以維持足夠的氧供，但長(zhǎng)時(shí)間高濃度氧療可對(duì)患者肺臟有一定的損傷，即高氧性急性肺損傷(Hyperoxia induced acute lung injury，HALI)，這嚴(yán)重影響了患者預(yù)后并增加了患者的住院時(shí)間及住院費(fèi)用[1-2]，但目前尚未找到更好的方法或藥物來(lái)治療或預(yù)防HALI，而尋找一種治療或預(yù)防HALI的方法或藥物成為當(dāng)前的首要任務(wù)。本研究擬通過(guò)過(guò)表達(dá)大鼠肺內(nèi)miRNA-21-5p，研究其對(duì)大鼠HALI形態(tài)學(xué)改變的影響，為HALI的基因治療尋找理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠96只，雌雄不拘，體重200 g左右，由重慶陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005。

1.2 miR-21-5p最佳滴度確定 分別取1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106TU /mL 6種不同滴度慢病毒液200 μL ，通過(guò)鼻腔滴入大鼠肺內(nèi)；滴入后0、24、48、72h處死大鼠并觀察大鼠肺組織大體變化及熒光顯微鏡觀察大鼠肺組織內(nèi)熒光變化情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 按隨機(jī)數(shù)字表法將96只大鼠分為正常組、HALI組和miR-21-5p組3組，每組32只。對(duì)照組直接飼養(yǎng)于空氣中；HALI組飼養(yǎng)于高氧箱(氧濃度90%以上，溫度保持在25～27 ℃，濕度保持在50%～70%，CO2濃度<0.5%)中制備HALI模型[3]；miR-21-5p組通過(guò)滴鼻法滴入200 μL帶有miR-21-5p的慢病毒液，再飼養(yǎng)于高氧箱中。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法 每組大鼠分別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后0 、24、48、72 h隨機(jī)抽取8只大鼠進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.1 miR-21-5p在肺組織內(nèi)分布情況 通過(guò)滴鼻法滴入帶有miR-21-5p的慢病毒液，使大鼠肺組織內(nèi)miR-21-5p高表達(dá)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察HALI大鼠肺組織內(nèi)熒光分布情況。

1.4.2 氧合指數(shù)(OI)和呼吸指數(shù)(RI)測(cè)定 于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)抽取大鼠動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?，?jì)算OI和RI。OI= PaO2/FiO2，式中，PaO2為動(dòng)脈氧分壓，F(xiàn)iO2為吸入氧濃度，本實(shí)驗(yàn)中FiO2均記為0.90；RI=P(A-a)O2/PaO2，式中，P(A-a)O2為肺泡-動(dòng)脈血氧分壓差。

1.4.3 肺組織病理學(xué)觀察及病理評(píng)分 頸動(dòng)脈放血處死大鼠，快速取右肺組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變；另外，每張病理切片隨機(jī)選擇3個(gè)高倍鏡視野(×200)，參照改良評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評(píng)分[4]，取平均值。

1.4.4 肺組織濕/干重(W/D)比值測(cè)定 頸動(dòng)脈放血處死大鼠取左肺，去除周?chē)Y(jié)蹄組織，并使用濾紙快速擦干組織表面水分，快速稱量，記為肺濕重(W)；再將該肺組織放置在80 ℃干燥箱中恒溫烘烤48 h，取出后再次稱量，直到重量恒定，記為肺干重(D)；根據(jù)以上數(shù)據(jù)計(jì)算肺W/D比值。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察miR-21-5p分布 頸動(dòng)脈放血處死各種滴度(1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106TU /mL)慢病毒轉(zhuǎn)染的大鼠，肉眼見(jiàn)肺組織大體變化不明顯，均表現(xiàn)為顏色分布均勻，略呈粉紅色，組織柔軟，未見(jiàn)出血點(diǎn)及組織腫脹。熒光顯微鏡下見(jiàn)：肺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)肺泡壁斷裂，間隔無(wú)增寬，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；隨著轉(zhuǎn)染滴度的增加，熒光密度逐漸增加；當(dāng)隨著轉(zhuǎn)染滴度的增加，熒光分布密度不再增加時(shí)濃度記為最佳轉(zhuǎn)染滴度。反復(fù)試驗(yàn)得出6×106TU /mL為最終實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染滴度。圖1為滴度6×106TU/mL慢病毒轉(zhuǎn)染各時(shí)間點(diǎn)的熒光圖片：轉(zhuǎn)染后0 h肺組織中熒光分布無(wú)或較少；轉(zhuǎn)染24 h熒光分布開(kāi)始出現(xiàn)在肺泡，分布較多且均勻；轉(zhuǎn)染48 h及72 h肺泡內(nèi)仍可見(jiàn)均勻分布的熒光顆粒。

滴度：(6×106 TU /mL)；綠色熒光代表miR-21-5p的慢病毒(×200)；A：轉(zhuǎn)染后0h肺組織結(jié)構(gòu)完整，間隔無(wú)增寬，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，綠色熒光分布較少，氣管附近偶見(jiàn)綠色熒光；B：轉(zhuǎn)染24 h肺組織結(jié)構(gòu)完整，間隔無(wú)增寬，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)大量綠色熒光分布，且分布較均勻；C：轉(zhuǎn)染48 h肺組織結(jié)構(gòu)完整，間隔無(wú)增寬，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，仍可見(jiàn)大量綠色熒光，且分布較均勻；D：轉(zhuǎn)染72 h肺組織結(jié)構(gòu)完整，間隔無(wú)增寬，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織內(nèi)仍可見(jiàn)綠色熒光，且分布較均勻。 圖1 慢病毒液滴入后各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織中miR-21-5p的分布情況

2.2 呼吸參數(shù)變化

2.2.1 OI變化 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組大鼠OI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，正常組大鼠OI無(wú)明顯變化(P>0.05)；HALI組大鼠OI逐漸降低(P<0.05)；miR-21-5p組大鼠24 h內(nèi)OI較實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)明顯降低(P<0.05)，但24 h后變化不大(P>0.05)。HALI組在高氧損傷24、48、72 h OI均明顯低于正常組(P均<0.05)；而miR-21-5p組各時(shí)間點(diǎn)OI均高于HALI組(P均<0.05，見(jiàn)表1)。

2.2.2 RI變化 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組大鼠RI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，正常組大鼠RI無(wú)明顯變化(P>0.05)；HALI組大鼠RI逐漸升高(P<0.05)；miR-21-5p組大鼠24 h內(nèi)RI較實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)明顯升高(P<0.05)，但24 h后變化不大(P>0.05)。HALI組在高氧損傷24、48、72 h RI明顯高于正常組(P均<0.05)；而miR-21-5p組各時(shí)間點(diǎn)RI均低于HALI模型組(P均<0.05，見(jiàn)表1)。

組別動(dòng)物數(shù)(只)OI(mmHg)0 h24 h48 h72 h0 h正常32449.83±30.22435.42±28.95460.02±18.56439.25±25.89HALI32450.95±30.54306.19±37.23ad268.52±25.24abd203.81±43.40abcdmiRNA21-5p32444.76±30.30358.10±29.25ad336.67±29.27ad323.81±19.05ad 續(xù)表組別動(dòng)物數(shù)(只)RI0 h24 h48 h72 h正常320.24±0.050.24±0.040.26±0.030.25±0.0HALI320.25±0.040.31±0.06ad0.38±0.06abd0.46±0.07abcdmiRNA21-5p320.25±0.050.30±0.05ad0.31±0.07ad0.29±0.04ad

miR-21-5p為微小RNA-21-5p，HALI為高氧性急性肺損傷，OI為氧合指數(shù)，RI為呼吸指數(shù)；1 mmHg=0.133kPa；a：與本組0h比較，P<0.05；b：與本組24 h比較，P<0.05；c：與本組48 h比較，P<0.05；d：與正常組比較，P<0.05；e：與HALI組比較，P<0.05。

2.3 肺組織病理學(xué)改變及病理評(píng)分 光鏡下觀察，各組大鼠實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無(wú)滲出及水腫，間隔無(wú)明顯增寬，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)明顯滲出物，隨時(shí)間延長(zhǎng)，正常組肺組織無(wú)明顯病理改變。HALI模型組損傷24 h肺組織結(jié)構(gòu)仍較清晰，肺泡間隔稍有水腫、增寬，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；48、72 h肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)肺泡壁斷裂破壞，肺泡腔塌陷，融合成肺大泡，肺泡間隔明顯水腫、增寬，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)水腫液及炎性細(xì)胞，可見(jiàn)少量紅細(xì)胞；肺組織病理評(píng)分隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，各時(shí)間點(diǎn)肺組織病理評(píng)分均明顯高于正常組(P均<0.05)。miR-21-5p組肺損傷較HALI組明顯減輕；各時(shí)間點(diǎn)肺組織病理評(píng)分均低于HALI組(P均<0.05，見(jiàn)圖2、表2)。

A：高氧損傷0 h，3組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰；B：高氧損傷24 h：3組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)較清晰，肺泡間隔稍有水腫、增寬，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)； C：高氧損傷48 h：正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)較清晰，HALI組以及miR-21-5p組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)肺泡壁斷裂破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)水腫液及炎性細(xì)胞，可見(jiàn)紅細(xì)胞，但miR21-5p組較HALI組損傷明顯減輕； D：高氧損傷72 h：正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)仍清晰，HALI組肺組織結(jié)構(gòu)均明顯紊亂，肺泡壁明顯斷裂破壞，肺泡腔塌陷，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺泡間隔及肺泡腔大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)紅細(xì)胞滲出，miR21-5p組肺泡損傷程度明顯較HALI組輕；HE染色 200×。 圖2 光鏡下觀察各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織病理學(xué)改變

組別 動(dòng)物數(shù)(只)0 h24 h48 h72 h正常 32 0.00±0.000.00±0.360.01±0.100.00±0.54HALI320.21±0.410.92±0.72ad3.13±1.38abd5.00±1.48abcdmiRNA21-5p 320.11±0.420.80±0.52ad1.32±0.92ad1.45±0.89ad

miR-21-5p為微小RNA-21-5p，HALI為高氧性急性肺損傷；a：與本組0 h比較，P<0.05；b：與本組24 h比較，P<0.05；c：與本組48 h比較，P<0.05；d：與正常組比較，P<0.05；e：與HALI組比較，P<0.05。

2.4 肺W/D比值變化 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組大鼠肺W/D比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨時(shí)間延長(zhǎng)，正常組和miR-21-5p組肺W/D比值無(wú)明顯變化(P均>0.05)，而HALI組肺W/D比值逐漸增加(P<0.05)。高氧損傷24、48、72 h，HALI組肺W/D比值均明顯高于正常組，而 miR-21-5p組肺W/D比值則明顯低于HALI組(P均<0.05，見(jiàn)表3)。

組別 動(dòng)物數(shù)(只)0 h24 h48 h72 h正常323.82±0.623.65±0.433.72±0.543.83±0.62HALI323.80±0.654.16±0.42ad4.66±0.35abd5.33±0.26abcdmiRNA-21-5p323.79±0.453.78±0.36e3.95±0.32e3.88±0.30e

miR-21-5p為微小RNA-21-5p，HALI為高氧性急性肺損傷，肺W/D比值為肺濕/干重比值；a：與本組0h比較，P<0.05；b：與本組24 h比較，P<0.05；c：與本組48 h比較，P<0.05；d：與正常組比較，P<0.05；e：與HALI組比較，P<0.05。

3 討論

近年研究顯示，F(xiàn)iO2大于0.90超過(guò)24 h即可導(dǎo)致HALI，其主要病理表現(xiàn)為：肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)肺泡壁斷裂破壞，肺泡腔塌陷，融合成肺大泡，肺泡間隔明顯水腫、增寬，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)水腫液及炎性細(xì)胞等[3-5]。HALI的發(fā)病機(jī)制目前并不是很清楚，近年研究主要集中在氧化-抗氧化系統(tǒng)和致炎-抗炎系統(tǒng)兩方面；在正常條件下，上述兩系統(tǒng)均處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，以保障機(jī)體正常生理功能；但當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期暴露在高氧環(huán)境時(shí)，上述兩種系統(tǒng)均會(huì)被打破，處于失衡狀態(tài)，最終導(dǎo)致HALI[6-7]；如果這一失衡不及時(shí)糾正，將會(huì)形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步加重HALI[8]。進(jìn)一步研究顯示，HALI發(fā)生的本質(zhì)是肺泡上皮細(xì)胞的凋亡，并且肺泡上皮細(xì)胞的凋亡貫穿于HALI的整個(gè)過(guò)程，抑制其凋亡，可以明顯減輕HALI[9-10]。

有研究顯示，F(xiàn)iO2較低或是短時(shí)間內(nèi)吸入較高濃度的氧對(duì)肺組織無(wú)形態(tài)學(xué)破壞或破壞較小，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肺部可產(chǎn)生大量氧自由基，后者可促進(jìn)肺部炎性因子和趨化因子的分泌，并在肺組織聚集，最終導(dǎo)致肺組織的炎癥性病理改變[11-12]。OI是監(jiān)測(cè)呼吸功能的重要指標(biāo)，在臨床上有助于診斷急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，并且OI的高低與肺部疾病嚴(yán)重程度有關(guān)[13]。 RI是臨床上用于判斷機(jī)體肺的通氣、換氣功能的一個(gè)簡(jiǎn)單而實(shí)用的重要指標(biāo)，受通氣/血流比值、肺彌散功能及通氣狀況的影響，但不受呼吸方式和FiO2的影響，故較PaO2的結(jié)果更可信，并且與OI呈明顯的負(fù)相關(guān)[14]；RI能較客觀地評(píng)價(jià)ARDS的病情變化，對(duì)治療ARDS具有重要的指導(dǎo)意義[15]。

miRNA是一類(lèi)新近發(fā)現(xiàn)的含有18-22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，廣泛表達(dá)于機(jī)體的各個(gè)組織和器官，在機(jī)體的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用；通過(guò)RNA干擾機(jī)制在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控約30%的人類(lèi)基因，并且這些基因參與了細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育到細(xì)胞凋亡的整個(gè)生命過(guò)程[16-17]。miR-21屬于miRNA家族，位于染色體17q23.2上，是具有自主轉(zhuǎn)錄單位的miRNA，它具有獨(dú)立的啟動(dòng)子，其表達(dá)不受其它基因啟動(dòng)子的調(diào)控[18]，這與共用一個(gè)啟動(dòng)子的miRNA不同，并且miR-21的啟動(dòng)子具有多個(gè)增強(qiáng)子結(jié)合位點(diǎn)，如信號(hào)傳到與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、水通道蛋白-1(AP-1)等，它們通過(guò)不同的信號(hào)通路來(lái)共同介導(dǎo)miR-21的表達(dá)，后者是一種抗凋亡基因，目前在腫瘤相關(guān)研究中最多，并且研究顯示miR-21在大多數(shù)腫瘤中高表達(dá)[19]。另有研究報(bào)道，miR-21可通過(guò)下調(diào)Bax/Bcl-2比值、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性、第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)及程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)的表達(dá)抑制人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞[20]、胃癌細(xì)胞[21]、神經(jīng)細(xì)胞[22]等多種細(xì)胞凋亡。

本課題組前期通過(guò)過(guò)氧化氫建立肺泡上皮細(xì)胞的凋亡模型，利用基因芯片技術(shù)篩選肺泡上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p高表達(dá)，并明確miR-21-5p可能是肺泡上皮細(xì)胞的重要抗凋亡基因[23]；進(jìn)一步研究顯示，miR-21-5p可能是通過(guò)下調(diào)Bax、caspase-3蛋白和上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗凋亡作用的[24]。本研究顯示，高氧吸入24 h后大鼠OI逐漸下降，RI、肺W/D比值及肺病理評(píng)分逐漸升高，肺組織結(jié)構(gòu)的病理破壞程度也同時(shí)增加；但當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-21-5p后發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p組OI明顯高于模型組，而RI、肺W/D比值及肺病理評(píng)分明顯低于模型組。由此說(shuō)明，miR-21-5p過(guò)表達(dá)能有效減輕HALI的程度，對(duì)大鼠肺形態(tài)學(xué)有顯著影響，但具體機(jī)制仍不清楚，尚需進(jìn)一步研究。