生防菌+惡霉靈最優組合的篩選及對苦瓜枯萎病的防治效果研究

王炎峰 田葉韓 魏滟潔 高克祥

（山東農業大學植物保護學院，山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室，山東泰安 271000）

苦瓜枯萎病是由尖孢鐮孢菌苦瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）引起的一種重要的土傳病害（Sun & Huang，1982）。該?；偷牟糠志瓿秩究喙贤猓€可以侵染葫蘆。此病原菌在苦瓜整個生長周期均可侵染，在盛果期發病最為嚴重。在苦瓜的主要種植區，由于高溫高濕的生長環境以及多年連作等原因，苦瓜枯萎病時常發生，造成嚴重的經濟損失（陳振東 等，2016）?？喙现仓晔艿讲≡秩竞笙虏咳~片的葉脈呈網狀黃化，上部葉片逐漸變黃，最后莖葉壞死，植株逐漸萎縮死亡，切開病株可發現其維管束變成褐色（陳振東 等，2014）。目前生產上對該病害的防治以農業栽培和化學農藥防治為主，但化學防治存在農藥殘留、抗藥性等問題（肖榮鳳 等，2015）。山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室調查發現市場上銷售的對西瓜、香蕉和甜瓜等枯萎病具有良好防效的微生物制劑對苦瓜枯萎病的防治效果不是很理想，因此，尋求一種安全有效的防治措施十分 必要。

綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）是一種極具生防潛力的重要生防菌，現已有大量關于綠針假單胞菌生物防治的研究報道，該菌對番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）有較好的防治效果（申順善 等，2016）；何延靜等（2006）發現綠針假單胞菌對辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）具有強拮抗作用。李惠（2009）研究發現綠針假單胞菌能夠誘發菜豆對灰霉病菌的抗性且能夠促進菜豆生長，并對楊樹腐爛病菌（Valsa sordida）、板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）等多種病菌都有較強的抑制作用。張清霞等（2018）研究發現綠針假單胞菌主要通過產生抗生素防治水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）；該菌對黃瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）、苦瓜枯萎病菌 （F. oxysporum f. sp. momordicae）均有較好的生防效果（侯圓圓，2017）。

惡霉靈不僅是內吸性殺菌劑，同時也是土壤消毒劑，對腐霉菌、鐮刀菌等引起的猝倒病有較好的預防效果（尹凱，2018）。惡霉靈對土壤中病原菌以外的細菌、放線菌的影響很小，故而對土壤中的微生物生態影響很小。

本實驗室前期研究發現綠針假單胞菌G5 對苦瓜枯萎病菌有較好的抑制作用，并對盆栽苦瓜枯萎病防治效果最優的生防菌+農藥組合進行了初步篩選（侯圓圓，2017），發現綠針假單胞菌G5+惡霉靈組合對盆栽苦瓜枯萎病的防治效果最優，但未進行不同濃度生防菌G5 與惡霉靈藥劑復配的篩選，因此，本試驗進一步優化生防菌+農藥組合配方，以求篩選出對苦瓜枯萎病防治效果更好的菌藥組合，并在田間條件下驗證其防效，為有效防治苦瓜枯萎病提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試苦瓜品種為如玉41 號，由福建農科農業良種開發有限公司生產；綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）G5 菌株，由本實驗室保存；苦瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）SG-15 菌株，由本實驗室分離并保存；99%惡霉靈（hymexazol，簡稱Hym）原藥由濰坊華諾生物科技有限公司生產、山東天達生物股份有限公司監制，按照推薦使用濃度稀釋4 000 倍使用；培養基：LB 培養基、 LA 培養基、PDB 培養基、PDA 培養基；盆栽用土：選擇10 a 以上無耕作的樹林土，與基質按照2∶1 的體積比混勻，所用基質購自山東風景園林有限公司；防御酶測定試劑盒：過氧化物酶（A084-3）、苯丙氨酸解氨酶（A137）、多酚氧化酶（A136）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。

試驗于2017 年4～9 月進行。生防菌+農藥最適組合的篩選于山東農業大學北校區溫室完成；防御酶活性測定于山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室完成；生防菌+農藥最優組合的田間防效試驗于山東農業大學南校區完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠針假單胞菌G5 菌懸液和苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液的制備 綠針假單胞菌G5 在LA 固體培養基上28 ℃培養24 h 至長出單菌落，挑取單菌落再次純化，挑取純化出的單菌落加入到含有40 μg · mL-1利福平（Rif）的LB 培養基中于28 ℃恒溫振蕩培養17 h，10 000 r · min-1離心10 min 去除培養液，將細菌沉淀用自來水重懸。用比濁法將G5 菌 懸 液 調 節 成1×108、1×109cfu · mL-12 個 濃度。

苦瓜枯萎病菌SG-15 菌株孢子懸浮液的制備：配制PDB 培養液，250 mL 的錐形瓶中裝液量為150 mL，高壓濕熱滅菌，冷卻后每瓶中接入3 塊直徑為6 mm 的苦瓜枯萎病菌菌餅，26 ℃恒溫160 r · min-1振蕩培養7 d，用滅菌過的濾網過濾菌絲，得到孢子懸浮液，用血球計數板計數，確定孢子懸浮液濃度。

1.2.2 G5+惡霉靈對盆栽苦瓜幼苗的促生效果 2017 年4 月選用顆粒飽滿的苦瓜種子，用無菌水洗3～5 次，放入50～60 ℃無菌水中浸泡，水沒過種子，用無菌的封口膜覆蓋瓶口，轉移到28 ℃恒溫搖床中160 r · min-1振蕩6～8 h。用無菌水把滅菌的紗布潤濕，平鋪在培養皿中上下各4 層，中間放置浸泡過的苦瓜種子，置于32 ℃恒溫培養箱中催芽48 h 左右。種子露白后播于50 穴的育苗盤中，放置在光照培養箱中培養，設置光照時間14 h、溫度26 ℃，黑暗時間10 h、溫度22 ℃。幼苗長到兩葉一心時移栽。

取制備好的盆栽用土裝入高10 cm、內口徑寬12 cm 的花盆中，每盆200 g，共設置12 個處理，每處理9 盆，每盆移栽1 株苦瓜，3 次重復。惡霉靈推薦使用濃度為250.0 mg · L-1，本試驗用1×108、1×109cfu · mL-12 個濃度的G5 菌懸液將惡霉靈稀釋至250.0、187.5、125.0、62.5 mg · L-14 個濃度（分別為推薦使用濃度的100%、75%、50%、25%），移栽時每盆相應澆灌10 mL G5 菌懸液、惡霉靈及二者組合至苦瓜根部，具體盆栽試驗設計見表1。

苦瓜移栽后15 d 對苦瓜株高、莖粗、葉面積及全株鮮質量、干質量進行測定。株高、莖粗的測定參照李雪玲（2018）的方法。葉面積測定參照柏軍華等（2005）的方法。用清水沖洗根部土壤，吸干苦瓜體表水分，在電子天平上測定鮮質量。接著將苦瓜植株放入烘干箱，105 ℃殺青處理30 min，85 ℃下烘干至重量不再變化，測定干質量。

表1 盆栽試驗設計

1.2.3 G5+惡霉靈對盆栽苦瓜枯萎病的防治效果 取制備好的盆栽用土裝入高10 cm、內口徑寬12 cm 的花盆中，每盆200 g，向每盆加入制備好的苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液，使每克土壤中病菌孢子為1×106個，在自然狀態下風干，將風干帶菌土壤混勻后立即移栽苦瓜。每處理設置3 次重復，每重復15 盆，每盆1 株苦瓜。除將1.2.2 中的健康土換成含有苦瓜枯萎病菌的病土外，其他操作均與1.2.2相同，此時將清水處理記為CK。

在苦瓜移栽15 d后以重復為單位調查統計苦瓜枯萎病的發病率、病情指數，并計算防治效果?？喙峡菸∶缙诓『Ψ旨墭藴剩愓駯| 等，2014）：0 級，植株健康，無病癥；1 級，子葉發黃；3 級，子葉變黃，邊緣皺縮，但真葉正常；5 級，子葉有皺縮枯死現象，部分真葉開始發黃；7 級，真葉發黃，部分葉片黃化或停止生長；9 級，全株萎蔫或 枯死。

1.2.4 G5+惡霉靈對盆栽苦瓜幼苗葉片防御酶活性的影響 試驗共設置CK0、CK、B、Hym、B+0.75Hym 5 個處理，處理方法同1.2.3。取移栽 前、移栽后3、6、9、12、15 d 6 個時期生長情況一致的苦瓜植株底部葉片，每處理隨機選取3 株，用液氮運輸并充分研磨均勻，采用防御酶測定試劑盒對苦瓜防御酶進行測定。

1.2.5 苦瓜枯萎病高發病樣地模型制備 本試驗以山東農業大學植保試驗站（北緯 36°18′，東經 117°17′）為定位試驗平臺。人為引入苦瓜枯萎病菌，將制備好的苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液用自來水稀釋100 倍后按1∶1 的質量比與草炭土混勻，繼續進行二次擴繁，30 d 后將擴繁好的含病原菌草炭均勻撒入試驗田中（1 kg · m-2），旋耕整地，將健康土壤轉化為枯萎病高發病土壤，試驗區域土壤中病原菌的含量為1×103～1×104cfu · g-1（干土）。以此為模型，驗證盆栽試驗篩選出的生防菌G5+惡霉靈最優組合對苦瓜枯萎病的田間防治效果。

1.2.6 G5+惡霉靈對苦瓜枯萎病的田間防治效果 試驗由隨機挑選的4 個區域構成，每個試驗區域長12 m、寬1.2 m，種植2 行苦瓜，前后株間距0.6 m，左右株間距1.0 m。每一區域對應一組處理，每個處理種植30 株苦瓜。共設置CK、B、Hym、B+0.75Hym 4 個處理，苦瓜移栽前打好定植穴，每個定植穴中澆灌100 mL 4 個處理的菌、藥、菌藥最優組合，移栽后30 d 再次澆灌100 mL 上述菌、藥或菌藥最優組合。分別于移栽后30、60 d 調查苦瓜枯萎病的發病情況，病情指數與防治效果的計算方法同1.2.3。試驗期間測定小區苦瓜總產量。

苦瓜枯萎病田間發病嚴重度分級標準（李雪玲，2018）：0 級，無病癥；1 級，輕微發病，30%以下的葉片出現葉脈黃化現象；3 級，中度發病，30%～70%的葉片出現葉脈黃化現象；5 級，高度發病，全株葉片葉脈黃化，未明顯影響植株的生長發育；7 級，全株葉片葉脈黃化且呈現萎蔫癥狀，維管束變褐，植株停止生長發育；9 級，植株 死亡。

1.3 數據分析

利用 SPSS 20.0 和 Excel 2007 軟件對數據進行方差分析、顯著檢驗并作圖。

2 結果與分析

2.1 G5+惡霉靈不同組合對盆栽苦瓜幼苗的促生效果

苦瓜盆栽試驗結果表明：施用綠針假單胞菌G5、惡霉靈及二者組合處理能夠明顯提高苦瓜莖粗、株高、葉面積、干質量、鮮質量，表現出不同的促生效果?？傮w來看，B+0.75Hym 處理（1×109cfu · mL-1G5 菌 懸 液+187.5 mg · L-1惡霉靈）各項生理指標均較高，促生效果最為明顯 （表2）。

2.2 G5+惡霉靈不同組合對盆栽苦瓜枯萎病的防治效果

試 驗 結 果 顯 示（表3），與1×108cfu · mL-1G5 菌懸液相比，1×109cfu · mL-1G5 菌懸液與惡霉靈各濃度復配對苦瓜枯萎病的防治效果較高；其中B+0.75Hym 處理對苦瓜枯萎病的防治效果為81.60%，明顯高于其他處理，單獨使用1×108cfu · mL-1G5 菌懸液對苦瓜枯萎病的防治效果為26.34%，低于其他處理。G5+惡霉靈各組合對苦瓜枯萎病的防治效果都要高于單獨使用生防菌G5 或惡霉靈。

2.3 G5+惡霉靈不同組合對盆栽苦瓜幼苗葉片防御酶活性的影響

2.3.1 G5+惡霉靈不同組合處理下苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性變化 在整個取樣周期中，PAL 活性呈現出先迅速升高后下降的趨勢，CK0、CK、Hym 處理的苦瓜葉片PAL 活性在移栽后3 d 達到峰值；B+0.75Hym 處理的苦瓜葉片PAL 活性持續升高時間較長，在移栽后6 d 出現峰值。在整個取樣周期內CK、Hym、B+0.75Hym 處理的苦瓜葉片PAL 活性總體高于CK0。Hym 處理的苦瓜葉片PAL 活性在移栽后3～12 d 變化較為平穩，但在12～15 d 劇烈下降。15 d 時PAL 活性表現為B+0.75Hym ＞B ＞CK ＞CK0 ＞Hym（圖1-A）。

2.3.2 G5+惡霉靈不同組合處理下過氧化物酶（POD）的活性變化 CK0、CK 處理的苦瓜幼苗葉片POD 活性呈持續平穩上升趨勢，移栽后9 d Hym 處理的POD 活性達到峰值后持續下降，活性下降幅度最大；12 d 時B 處理的POD 活性達到最大值；移栽后12～15 d 處理CK0、CK、B、Hym的 POD 活性均呈現下降趨勢，而B+0.75Hym POD活性在15 d達到峰值，顯著高于其他處理（圖1-B）。

表2 G5+惡霉靈不同組合對盆栽苦瓜幼苗的促生效果

表3 G5+惡霉靈不同組合對盆栽苦瓜枯萎病的 防治效果

2.3.3 G5+惡霉靈不同組合處理下多酚氧化酶（PPO）的活性變化 不同處理的PPO 活性總體呈現上升趨勢。移栽后3～6 d 出現小幅下降，隨后又持續上升。移栽后9 d B+0.75Hym 處理的PPO活性高于其他處理，12～15 d B 處理的PPO 活性持續上升，在15 d 時達到峰值，此時PPO 活性大小依次為B ＞Hym ＞B+0.75Hym ＞CK0 ＞CK（圖1-C）。

2.4 盆栽試驗篩選出的菌藥最優組合對苦瓜枯萎病的田間防治效果

從表4 可以看出，苦瓜幼苗移栽后30 d，對枯萎病的防治效果為B+0.75Hym（52.59%）＞Hym（49.35%）＞B（45.46%）；苦瓜幼苗移栽后60 d 時，防治效果為B+0.75Hym（32.13%）＞B （28.51%）＞Hym（24.09%）；苦瓜產量的高低與移栽后60 d 的防治效果相對應。

圖1 G5+惡霉靈對盆栽苦瓜幼苗葉片防御酶活性的影響

3 結論與討論

綠針假單胞菌G5 是分離自芫荽（香菜）莖內的一株內生菌，研究發現菌株G5 可產生多種次生代謝物質，如吩嘖衍生物、氫氰酸（HCN）、嗜鐵素和蛋白酶、植物生長素（IAA）等（李惠，2009）。侯圓圓（2017）通過平板對峙試驗，發現綠針假單胞菌G5 菌株對苦瓜枯萎病菌SG-15 菌株的菌絲具有明顯拮抗作用，采用不同接種方法，G5 菌株對SG-15 菌株菌絲生長的抑制率達到60%以上；試驗還發現惡霉靈能夠抑制苦瓜枯萎病菌的菌絲生長，故而能夠減輕苦瓜枯萎病的發生。本試驗將生防菌G5 與殺菌劑惡霉靈結合起來協同防治苦瓜枯萎病。試驗結果表明，供試的8 種G5+惡霉靈組合防治盆栽苦瓜枯萎病的效果都要高于單獨使用生防菌或農藥，其中B+0.75Hym 處理（1×109cfu · mL-1G5+187.5 mg · L-1惡霉靈）的防治效果最好（表3），與此相似，曹小蕾等（2016）研究發現將殺菌劑、植物誘抗劑和生防微生物共同施用時能夠更有效地抑制棉花黃萎病的發生。但張志紅等（2011）研究發現生物肥與惡霉靈配施加重了香蕉枯萎病的發生，與本試驗結果不一致，這可能是因為本試驗中配施的惡霉靈濃度較低，且惡霉靈對生防細菌的影響較小造成的。

逆境脅迫破壞植株正常的生長和發育（楊書運 等，2007），影響植物生理活動、動態平衡（Wahid et al.，2007；鄧茳明 等，2010），受逆境脅迫后植株組織內防御酶活性升高，以增強植物抗性 （Ashraf ＆ Foolad，2007）。臺蓮梅等（2008）研究發現不同大豆品種用尖孢鐮孢菌毒素處理后根內PAL、PPO、POD 活性都要高于對照組，與其相似，本試驗發現帶菌土壤（CK）苦瓜葉片內的PAL、POD、PPO 活性總體高于健康土（CK0）（圖1）。連清貴等（2016）研究發現番茄植株長勢健壯時相關防御酶活性較高，灰霉病發生程度降低，與此相似，本試驗發現對盆栽苦瓜促生效果最為明顯的B+0.75Hym 處理對苦瓜枯萎病的防治效果最佳（表2、3、4），同時在整個取樣周期內PAL、POD、PPO 3種防御酶的活性總體上表現較高。由此可見，植株的生長指標與病害的發生情況及相關的防御酶系統之間存在著密切的聯系。

盆栽試驗中篩選出的最優菌藥組合B+0.75Hym 在防治苦瓜枯萎病田間試驗中得到了有效的肯定，田間條件下，苦瓜苗移栽后30、60 d B+0.75Hym 處理對苦瓜枯萎病的防治效果高于單一施用B 或Hym；同時B+0.75Hym 處理的增產效果也最為明顯。本試驗僅將生防菌G5 與惡霉靈混合后加入到定植穴中，對于田間防效試驗中的生防菌+農藥的施用方式、施用時間仍需進一步的研究。