籽用和肉用印度南瓜果實發育過程中淀粉合成途徑相關基因的表達分析

王超杰 王云莉 徐文龍 韓宏宇 王志超 崔崇士 屈淑平

（東北農業大學園藝園林學院，黑龍江哈爾濱 150030）

在高等植物中淀粉主要由兩種不同的葡聚糖聚合物組成：直鏈淀粉和支鏈淀粉。支鏈淀粉是天然淀粉的主要成分，是以α-1，6-糖苷鍵和α-1，4-糖苷鍵共同形成長度不一的分支并以一定的次序相結合的簇狀結構（Gentry et al.，2016）；直鏈淀粉是次要成分，是由α-1，4-糖苷鍵連接而成的線性多聚物，通常占總儲備淀粉的15%～35%（Vu et al.，2014）。植物種類和貯藏器官不同，其直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量和比例也有所不同。貯藏器官淀粉的合成（圖1）主要發生在質體中，由一系列關鍵的酶催化合成（Ball & Morell，2003；Stitt et al.，2010；Zeeman et al.，2010；Toyosawa et al.，2016；Wyatt et al.，2016）。淀粉合成的第一步是葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G6P）由葡萄糖磷酸轉運蛋白（GPT）將其由細胞質轉移至質體中。G6P 在質體葡萄糖磷酸變位酶（pPGM）的催化作用下生成葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate，G1P）。G1P 和ATP 在ADP-葡萄糖磷酸焦磷酸化酶（ADP-Glc pyrophosphorylase，AGPaseL）的催化下生成ADPG，ADPG 是直鏈淀粉和支鏈淀粉合成的共同前體，為淀粉鏈的延伸提供糖基，此過程中，質體內的ATP 主要是從胞質中由質體型ATP/ADP 轉 運 蛋 白（plastidic ATP/ADP transporter，AATP）運輸而來。顆粒結合型淀粉合成酶（granule-bound starch synthase，GBSS）主要負責直鏈淀粉糖鏈的延伸。可溶性淀粉合成酶（soluble starchsynthase Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，SSSⅠ～Ⅳ）主要負責支鏈淀粉糖鏈的延伸，支鏈淀粉中α-1，6-糖苷鍵的引入主要是由淀粉分支酶（starch-braching enzyme，SBE）完成，而淀粉去分支酶（debranching enzyme，DBE）的主要作用是水解不正確的α-1，6-糖苷鍵分支，對支鏈進行修飾。

圖1 植物淀粉的生物合成途徑（Wyatt et al.，2016）

淀粉是南瓜果肉的重要成分，淀粉含量的高低與南瓜果實的食用口感相關，南瓜收獲時，干物質與淀粉含量越高，果肉口感越面（Hurst et al.，1995）。Nakkanong 等（2012）研究了中國南瓜（Cucurbita moschata）、印度南瓜（Cucurbita maxima）和種間雜種（Maxchatal）果實發育過程的6 個時期淀粉代謝相關基因的表達量及淀粉組成，結果顯示AGPaseL 與GBSSⅠ基因的轉錄水平與淀粉含量變化趨勢一致，SSSⅡ、ISAⅠ和SBEⅡ基因與支鏈淀粉合成相關。Wyatt 等（2016）對美洲南 瓜（Cucurbita pepo）Sweet REBA 和Lady Godiva 進行轉錄組測序，確定了在美洲南瓜果實發育過程中的蔗糖和淀粉代謝相關的酶基因，并對其表達量進行研究。王安君（2017）對不同發育時期的中國南瓜（Cucurbita moschata）CMO-X 和CMO-E 以及印度南瓜（Cucurbita maxima）CMA的果實進行高通量測序，探究果實糖類和淀粉合成調控網絡，篩選出蔗糖和淀粉代謝途徑差異表達的基因共12 個，結合qRT-PCR 驗證中國南瓜CMO-X 和CMO-E 中差異基因表達量與相關代謝物含量的關系，確定GBSS、SSS 和SBE 為淀粉合成途徑關鍵基因。

雖然直鏈和支鏈淀粉在南瓜果實發育過程中的積累與其代謝關鍵酶基因表達量之間的關系有多篇報道，但對于印度南瓜果實發育過程中直鏈淀粉和支鏈淀粉的積累與關鍵酶基因表達量的關系報道較少。肉用印度南瓜果實口感緊實、甜面，深受消費者青睞，籽用印度南瓜果實口感疏松，果肉基本全部廢棄。因此，本試驗以肉用印度南瓜和籽用印度南瓜高代自交系材料為研究背景，探究籽用和肉用印度南瓜品種果肉中直鏈和支鏈淀粉的積累模式及合成途徑中關鍵酶基因表達量的差異，以期為南瓜品質育種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

籽用印度南瓜自交系98-2，果實口感疏松；肉用印度南瓜自交系312-1，果實口感粉面；均由東北農業大學園藝園林學院南瓜分子遺傳育種研究室提供。2017 年5 月中旬，在黑龍江省哈爾濱市東北農業大學向陽基地種植，每份材料種植30 株，株距50 cm，行距140 cm，3 次重復，均采用常規栽培管理方式及水肥供給。人工輔助授粉，并掛標記牌，每個單株只留1 個瓜。在不同的果實發育階段（授粉后5、10、20、30、40、50 d）進行取樣，每個時期2 份材料分別選取3 個長勢一致且無機械損傷的果實，離體后立即縱切，取南瓜果肉部分用錫箔紙包裹后迅速在液氮中冷凍，儲存于-80 ℃冰箱中。

1.2 干物質含量的測定

取上述冷凍南瓜果肉部分測定每份材料的干物質含量，即將果肉在65 ℃條件下烘干至恒重，測定其干質量。

1.3 南瓜淀粉的提取

將冷凍南瓜果肉取出后，于-50 ℃冷凍干燥48 h，磨粉，將干粉過100 目篩。按 Stevenson 等（2005）的堿提取方法提取南瓜淀粉，取過篩后干粉加10 mL 0.05% NaOH 放置20 h；用蒸餾水反復清洗3 次，5 000 r · min-1離心10 min 后加入19 mL 0.1 mol · L-1NaCl 和0.1 mL 10%甲苯渦旋混勻，離心棄上清液；再用蒸餾水清洗3 次，乙醇洗2 次，用冷凍干燥機干燥樣品，即得到粗提的南瓜 淀粉。

1.4 總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉含量的測定

取上述粗提的南瓜淀粉磨粉后的南瓜干粉15 mg，用5 mL 80% Ca（NO3）2懸浮，在沸水中水浴10 min，于4 000 r · min-1條件下離心4 min 后將上清液轉入20 mL 容量瓶中，殘渣用80% Ca（NO3）2重復提取 2 次，合并提取液，定容至20 mL。每個處理3 次重復，參照徐昌杰等（1998）的測定方法測定總淀粉含量。

稱取粗提的南瓜淀粉15 mg，加入1.0 mL 1 mol · L-1NaOH 溶液，30 ℃恒溫箱內糊化20 h。加入2～3 mL 水，于沸水中分散8 min。取3 mL 分散液，加入1 mL 脫脂液，靜置10 min，棄去上層，重復脫脂 3 次。吸取脫脂液0.5 mL，加入5 mL 水、0.1 mol · L-1乙酸溶液1 mL、0.02%碘試劑1.5 mL定容。顯色10 min 后于620 nm 波長處測定吸光度值。參照楊金華等（1992）的方法繪制混合標準曲線，計算直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。

1.5 RNA 的提取及cDNA 的合成

采用 Trizol（Invitrogen USA）法提取不同果實發育階段南瓜果肉RNA。RNA 的質量和濃度通過超微量紫外分光光度計（SMA 4000 Merinton USA）進行檢測。同時用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。cDNA 合成使用 Rever Tra Ace q-PCR RT Master Mix with gDNA Remover（Code No. FSQ-301，TOYOBO，JAPAN） 試 劑 盒。0.5 μg RNA 加2 μL 4 × DN Master Mix（已添加 gDNA Remover），加入RNase-free ddH2O 至 8 μL，混勻后于37 ℃水浴5 min。cDNA 合成用上面提到的8 μL 反應液加2 μL 的5× RT Master MixⅡ至 10 μL混勻，37 ℃水浴15 min；98 ℃水浴5 min，于-80 ℃條件保存。

1.6 淀粉合成途徑關鍵酶基因表達分析

選擇10 個參與淀粉合成途徑的相關酶基因進行表達分析，部分引物參照Nakkanong 等（2012）文獻中的引物序列，引物信息見表1。以Actin 為內參基因。應用天根生化科技（北京）有限公司RealMaster Mix SYBR Green（Code No.FP202） 試劑盒進行qRT-PCR。qRT-PCR 反應體系包括1 μL稀釋的cDNA，上下游引物各1 μL，9 μL 的2.5×Real Master Mix（with 20×SYBR Solution）反應液，加8 μL RNase-free ddH2O 到20 μL。所有反應液均在冰上配制，之后徹底混勻。qRT-PCR 擴增程序為：95 ℃預變性10 min；40 個循環，每個循環包括95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s。所有cDNA 均進行3 次重復。

2 結果與分析

2.1 南瓜果實發育過程中干物質和淀粉積累的變化

南瓜果實發育過程中干物質含量測定結果表明（表2），在授粉后5 d，2 份材料中干物質含量差異不大，隨著果實的發育，肉用南瓜312-1 中干物質呈現快速積累，在授粉后40 d 達到峰值，在果實成熟后期（授粉后50 d）略有下降，而籽用南瓜98-2 的干物質含量一直變化不大，維持在發育初期的水平，沒有顯著積累的過程，在授粉后50 d達到峰值。授粉后10～50 d，2 份材料之間的干物質含量差異均達顯著或極顯著水平。

如表3 和圖2 所示，在果實發育過程中，2 份材料312-1 和98-2 的總淀粉和支鏈淀粉積累模式存在明顯差異，312-1 中總淀粉和支鏈淀粉積累模式相似，都是隨著果實發育逐漸積累，在授粉后40 d 時達到高峰，隨后略有下降；而98-2 中總淀粉和支鏈淀粉含量一直維持在果實發育初期（授粉后5 d）水平，沒有顯著積累的過程；在果實發育的各個時期，312-1 中總淀粉和支鏈淀粉含量均極顯著高于98-2。在授粉后40 d 時312-1 果實中總淀粉和支鏈淀粉含量分別為53.84%和41.85%，而98-2 果實中總淀粉和支鏈淀粉含量分別為8.29%和5.70%。

表1 實時熒光定量PCR 引物

表2 南瓜果實發育過程中干物質含量的變化

表3 南瓜果實發育過程中淀粉含量的變化

圖2 98-2（A）和312-1（B）在果實發育6 個時期的淀粉積累量

2 份材料中直鏈淀粉的積累模式大致相同，都是維持在果實發育初期的水平，沒有顯著積累過程，在發育過程中略有上下波動。果實發育的不同時期312-1 中直鏈淀粉含量均顯著或極顯著高于98-2，在授粉后40 d 時312-1 果實中直鏈淀粉含量為11.99%，而98-2 果實中直鏈淀粉含量為2.59%，兩者相差4.6 倍。

在淀粉組成上，2 份材料均是以支鏈淀粉為主。在整個果實發育期間，312-1 中支鏈淀粉含量平均為總淀粉含量的71.27%，98-2 中支鏈淀粉含量平均為總淀粉含量的79.00%，2 份材料在淀粉組成上差異不大。

2.2 南瓜果實發育過程中淀粉合成途徑關鍵酶基因表達量的變化

淀粉合成途徑中10 個關鍵酶基因在2 份南瓜材料果實發育不同時期的相對表達量變化如圖3 所示。除ISA Ⅲ、SSSⅡ和SBEⅡ基因外，其他7 個基因的表達模式相似，均是在2 份材料果實發育前期（授粉后5 d）高度表達，在果實發育中后期表達量均維持在相對較低的水平，其中GPT、AGPaseL、GBSSⅠ 和SSS Ⅲ這4 個基因在2 份材料不同果實發育期均存在顯著或極顯著差異。

GPT 和GBSSⅠ基因在312-1 果實發育前2個時期的表達量均極顯著高于98-2，但授粉20 d 之后GPT 和GBSSⅠ基因的表達量均顯著或極顯著低于98-2。312-1 果實發育過程中AATP、AGPaseL、SBEⅠ（除授粉后30 d）、SSSⅡ（除授粉后10 d）和SSS Ⅲ基因的表達量均高于98-2。PGM 基因除授粉后5 d 和30 d，其他各個時期均是312-1 中的表達量低于98-2。ISA Ⅲ基因在2 份材料中的表達量大體呈現“V”字形變化趨勢，該基因在授粉后5、30 d 和50 d 時312-1 中的表達量顯著高于98-2，其余各時期2 份材料間差異不顯著。SBEⅡ基因在312-1 授粉后5 d 和10 d 的表達量顯著低于98-2，后期則相反。

圖3 南瓜果實發育過程中10 個淀粉合成途徑關鍵酶基因的相對表達量

3 結論與討論

南瓜干物質和淀粉含量與南瓜口感品質關系密切（Ferriol & Picó，2008；孫守如 等，2008；徐麗珊 等，2009；尹玲 等，2012）。本試驗中，肉用印度南瓜312-1 中干物質和總淀粉含量均大于同期籽用印度南瓜98-2，98-2 口感疏松，312-1 口感緊實、面而粉，結合2 份南瓜果實中的淀粉和干物質含量，推斷南瓜質地緊實、粉質與南瓜中淀粉和干物質含量有關。

在2 份印度南瓜材料果實發育過程中，肉用印度南瓜312-1 果實中的直鏈和支鏈淀粉的積累均顯著或極顯著高于籽用印度南瓜98-2。除ISA Ⅲ、SSSⅡ 和SBEⅡ 基 因 外，GPT、AATP、PGM、AGPaseL、GBSSⅠ、SSS Ⅲ和SBEⅠ基 因 在2 份材料果實發育過程中表達模式相似，各基因表達量在2 份材料中存在較大差異。GPT、AATP 和AGPaseL 主要參與淀粉合成前體物質（ADPG）的合成。前人從基因表達和轉錄組學研究中已證明GPT、AATP 和AGPaseL 基因在南瓜淀粉合成中的重要作用。Wyatt 等（2016）發現在美洲南瓜Sweet REBA 果實發育過程中GPT 和AATP 的轉錄水平高于Lady Godiva，且Sweet REBA 果實中的淀粉含量高于Lady Godiva。Nakkanong 等（2012）研究發現在印度南瓜和Maxchata 中AGPaseL 基因的轉錄水平與淀粉含量變化趨勢一致，AGPaseL 基因在印度南瓜和Maxchata 中高度表達導致其積累較多的淀粉。本試驗中，GPT、AATP 和AGPaseL基因均在2 份材料果實發育前期（授粉后5 d 和授粉后10 d）高表達，且在312-1 中的表達量顯著或極顯著高于98-2，推測GPT、AATP 和AGPaseL在印度南瓜果實淀粉合成過程中起著關鍵作用。GBSS 是直鏈淀粉生物合成的關鍵酶，GBSSⅠ基因的表達與許多植物的貯藏器官中直鏈淀粉含量具有明顯的相關性，例如馬鈴薯（Kozlov et al.，2007）、木薯（Raemakers et al.，2005）和甘薯（Otani et al.，2007）。在本試驗中，2 份材料在果實發育早期直鏈淀粉便高度積累，GBSSⅠ基因在果實發育早期（授粉后5～10 d）的表達量較高，且在312-1果實中的表達量極顯著高于98-2，推測GBSSⅠ基因是調控印度南瓜果實中直鏈淀粉積累的關鍵酶基因。SSS、SBE 和DBE 共同參與支鏈淀粉的生物合成（高振宇 等，2004；Tetlow et al.，2008；鄭義 等，2009），本試驗中SSSⅡ、SSSⅢ、SBEⅠ和SBEⅡ基因在312-1 果實發育多個時期的表達量顯著高于98-2，312-1 支鏈淀粉的含量也極顯著高于98-2，推測SSSⅡ、SSSⅢ、SBEⅠ和SBEⅡ基因是調控印度南瓜果實中支鏈淀粉積累的關鍵酶基因。在水稻中有研究表明ISA Ⅲ基因參與淀粉的降解（Yun et al.，2011），本試驗中2 份材料在授粉后50 d SSSⅡ和ISAⅢ基因高度表達，授粉后50 d 果實中支鏈淀粉含量也下降，SSSⅡ和ISA Ⅲ基因是否參與淀粉的降解還有待進一步研究。